Zu Beginn legen Sie die euthanasierte Ratte mit der Bauchseite nach oben auf die Sezierfläche. Kneifen Sie die Hautschicht mit einer sterilen Pinzette zusammen und machen Sie Schnitte an der Oberfläche, um Schäden an inneren Organen zu vermeiden. Machen Sie mit einer großen, scharfen Präparierschere einen Längsschnitt in der Mitte des Bauches.
Machen Sie dann ausgehend von diesem Schnitt zwei kürzere horizontale Schnitte, einen auf jeder Seite. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette ab, um die Bauchhöhle freizulegen. Durchtrennen Sie die Peritonealmembran, um die inneren Organe in der Bauchhöhle mit leichtem Zugang zum Darm vollständig freizulegen.
Lokalisieren Sie mit Schere und Zange den Magen und identifizieren Sie den Zwölffingerdarm, der etwa zwei bis drei Zentimeter distal davon liegt und als gelbliches Segment erscheint. Das proximale Jejunum befindet sich etwa vier bis fünf Zentimeter distal des Treitz-Bandes. Eine Landmarke zwischen Zwölffingerdarm und Jejunum.
Legen Sie das isolierte Darmfragment in eine 10 Zentimeter große Petrischale. Spülen Sie das gewünschte Darmsegment des Mesenteriums mit 10 Millilitern eiskaltem PBS, bis es vom luminalen Inhalt befreit ist. Schneide das Darmsegment auf einem Papiertuch in zwei Zentimeter lange Stücke.
Öffnen Sie dann jedes Darmstück der Länge nach, um das Epithel freizulegen. Kratzen Sie die freigelegte luminale Oberfläche mit einem Objektträger aus Glas ab, um Zotten zu entfernen. Legen Sie die Darmstücke in die EDTA-Lösung auf Eis und drehen Sie sie 30 Minuten lang um vier Grad Celsius auf einem auf 10 U/min eingestellten Schlauchrevolver.
Gießen Sie den Inhalt des Röhrchens am Präpariermikroskop in eine 10 Zentimeter lange Petrischale. Füge zusätzlich fünf Milliliter eiskaltes PBS hinzu. Halten Sie mit einer feinen Pinzette ein Darmsegment fest und schütteln Sie es kräftig, um die Freisetzung des Epithels in das PBS zu beobachten.
Zu Beginn wird die PBS hauptsächlich Zotten enthalten. Schütteln Sie die Darmfragmente kontinuierlich, verwerfen Sie regelmäßig die PBS-haltigen Zotten und fügen Sie 10 Milliliter frisches PBS zu den Darmfragmenten hinzu. Schütteln Sie die Fragmente weiter und wiederholen Sie den PBS-Waschschritt, bis die Zotten nicht mehr in das PBS freigesetzt werden.
Stattdessen enthält die PBS in erster Linie Krypten. Verwerfen Sie die restlichen Darmfragmente und reichern Sie das verbleibende PBS in der Petrischale für Darmkrypten an. Sammeln Sie die PBS-haltigen Krypten in einer Gewebekulturhaube und filtern Sie sie durch einen 70-Mikron-Zelldrainage.
Das Filtrat wird fünf Minuten lang bei 250 x g zentrifugiert. Entfernen Sie dann ihren Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millimeter fortschrittlichem DMEM plus. Nochmals bei 250 x g fünf Minuten zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie 50 Mikroliter Medien mit dem Pellet zurück. Resuspendieren Sie das Pellet in den verbleibenden Medien und fügen Sie es dem Aliquot des extrazellulären Matrixextrakts oder EME auf Eis hinzu. Pipetieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Krypten gleichmäßig in der EME aufzuhängen und Blasen zu vermeiden.
Geben Sie 50 Mikroliter der EME-Kuppeln in eine 35-Millimeter-Gewebekulturschale. Eine Inkubation bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 20 Minuten. Nach der Inkubation fügen Sie zwei Milliliter intestinales organoides Medium (RIOM) der Ratte hinzu, das jeweils 10 Mikromolare Y27632 und CHIR99021 enthält.
Als nächstes saugen Sie das Medium von einer Platte mit Organoiden ab, um die Darmorganoide von Ratten zu passieren, und fügen Sie einen Milliliter Dissoziationsreagenz hinzu, um die Organoide aus den EME-Kuppeln freizusetzen. Das Dissoziationsreagenz mit fragmentierten Organoiden wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die Kulturplatte mit zwei Millilitern fortschrittlichem DMEM plus und geben Sie es in das konische 15-Milliliter-Röhrchen, das die fragmentierten Organoide enthält.
Mit einer Weidepipette aus Glas vorsichtig 15 bis 20 Mal auf und ab pipettieren, um die Organoide zu fragmentieren. Die Organoide werden zwei Minuten lang bei 350 x g zentrifugiert und 50 Mikroliter Lösung vom Boden des Röhrchens in das EME gegeben. Nach dem Mischen der Lösung werden 50 Mikroliter der EME-Kuppeln in eine 35-Millimeter-Gewebekulturschale gegeben und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid 20 Minuten lang inkubiert.
Nach der Inkubation werden zwei Milliliter RIOM mit jeweils 10 Mikromolaren Y27632 und CHIR99021 zugegeben. Gezeigt werden repräsentative Bilder von Zottenfragmenten und Krypten. Krypten sind im Vergleich zu Zotten kleiner.
Die plattierten Krypten dehnen sich in den nächsten Tagen aus und beginnen am vierten bis siebten Tag zu knospen und sich zu differenzieren. Nach zweitägigem Auftauen zeigte eine gesunde Organoidkultur das Vorhandensein von Sphäroiden und knospigen Organoiden. Die gleiche Organoidlinie zeigte nach der Passage das Vorhandensein einzelner kryptenartiger Domänen.
