Um die Platte mit EME zu beschichten, verdünnen Sie EME 1 bis 20 in kaltem Advanced DMEM+Für die Beschichtung mit Kollagen verdünnen Sie fünf Milligramm pro Milliliter Kollagen I in Advanced DMEM+ auf 100 Mikrogramm pro Milliliter. Beschichten Sie die Platte mit 200 Mikrolitern verdünntem EME oder Kollagen, um die Well-Oberfläche vollständig zu bedecken, und inkubieren Sie ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Um Monolagen zu erzeugen, saugen Sie das Medium von einer 35-Millimeter-Platte ab, die Organoide enthält.
Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und unterbrechen Sie die EME in den Vertiefungen mit einer P1000-Spitze, indem Sie etwa 20 Mal auf und ab pipettieren, um die gesamte EME zu lösen. Füllen Sie den Inhalt in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie einen Milliliter PBS auf die Platte, um zusätzliche Organoide zu sammeln, und übertragen Sie sie in dasselbe konische Röhrchen.
Die Probe wird zwei Minuten lang bei 350 g zentrifugiert und der Überstand, einschließlich etwaiger EME-Rückstände, entfernt. Geben Sie dann einen Milliliter Trypsinlösung in das Organoid-Pellet und inkubieren Sie es zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Pipettieren Sie 10 Mal mit einer P1000-Spitze auf und ab und fügen Sie zwei Milliliter Advanced DMEM+ hinzu, um Trypsin zu neutralisieren.
Fünf Minuten lang bei 350 g zentrifugieren und den Überschuss absaugen, bevor das Pellet in 4,8 Milliliter rIOM2D resuspendiert wird. Entfernen Sie überschüssiges EME oder Kollagen in Advanced DMEM+ aus den Vertiefungen. Dann werden 200 Mikroliter Organoide in rIOM2D und 10 Mikromolare Y27632 in jede vorbeschichtete Vertiefung gegeben.
Nach 4 bis 16 Stunden wird das Medium aufgefangen und eine Minute lang bei 1.000 g zentrifugiert. Füllen Sie den Überstand in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Waschen Sie jede Vertiefung mit 300 Mikrolitern PBS, bevor Sie 200 Mikroliter des zentrifugierten rIOM2D in jede Vertiefung geben.
Wechseln Sie den rIOM2D-Wert alle zwei bis drei Tage, wodurch die Verwendung von Y27632.2D-Monolayern, die auf der EME plattiert wurden, ausgesetzt wurde, die sich leicht in kleine Sphäroide umformten, wenn EME wieder an die Oberseite der Zellen gegeben wurde. Im Gegensatz dazu war ein Kollagen-I-Substrat nicht ausreichend, um 3D-Strukturen zu reformieren.
