Bereiten Sie zunächst die Verdünnung mit den Serum- oder Hirnmarksflüssigkeitsproben des Patienten für den Test vor. Bereiten Sie das erforderliche Konjugat in der entsprechenden Arbeitskonzentration vor, indem Sie es in PBS mit 0,05 % Evansblau verdünnen. Bei indirekten fluoreszierenden Antikörpertests ist die für den Assay erforderliche Anzahl präparierter Antigen-Objektträger zu entnehmen.
Lassen Sie die Objektträger auftauen und vollständig trocknen. Als nächstes legen Sie die Objektträger in ein mit Aceton gefülltes Coplin-Glas und legen Sie sie für zwei Stunden bis über Nacht in einen Gefrierschrank mit minus 20 Grad Celsius, der für brennbare Materialien zugelassen ist. Anschließend die Objektträger aus dem Aceton entfernen und an der Luft trocknen lassen.
Legen Sie nun die Objektträger in die Feuchtigkeitskammerbox innerhalb der Biosicherheitswerkbank. Um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, geben Sie in destilliertes Wasser getränkte saugfähige Streifen in die Kammer. Tragen Sie 50 Mikroliter jeder Kontrollprobe, Probenverdünnung oder PBS auf die vorbestimmte Vertiefung auf.
Stellen Sie den geschlossenen Feuchtigkeits-Objektträger-Inkubator 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Luftfeuchtigkeit ein. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Feuchtigkeitsschieberkammer aus dem Inkubator und überführen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank. Mit einer Absaugspitze den Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung absaugen, ohne die Zellmonoschicht zu stören.
Tragen Sie anschließend mit einer sterilen Tropfpipette einen Tropfen PBS in jede Vertiefung auf. Saugen Sie das PBS vorsichtig an und geben Sie jeden Objektträger in ein mit PBS gefülltes Coplin-Glas. Als nächstes legen Sie die Objektträger zurück in die Feuchtigkeitskammerbox.
Tragen Sie 50 Mikroliter des entsprechenden Anti-Human-Antikörper-Konjugats auf jede Vertiefung auf und inkubieren Sie 30 Minuten lang in einem feuchten Inkubator. Am Ende der Inkubation wird die Feuchtigkeitskammer in eine Biosicherheitswerkbank überführt. Saugen Sie den Überstand mit einer Absaugspitze an.
Tragen Sie anschließend mit einer sterilen Tropfpipette einen Tropfen PBS in jede Vertiefung auf. Nachdem Sie den PBS entfernt haben, waschen Sie den Objektträger zweimal in einem Coplin-Glas PBS für insgesamt 15 Minuten. Lassen Sie die Objektträger nach dem Waschen an der Luft trocknen und montieren Sie dann ein Deckglas mit Eindeckmedien.
Nehmen Sie die Objektträger und lesen Sie sie unter Fluoreszenzmikroskopie. Bewerten Sie die Proben von negativ bis vier plus, wobei negative Proben keine Fluoreszenz und vier plus Proben eine hellgrüne Fluoreszenz aufweisen. Weisen Sie die Proben und den Endpunktwert zu, der durch den Verdünnungsfaktor dargestellt wird, bei dem die Probe einen Plusgrad von eins bis zwei aufweist.
Nach der Erstimpfung wurden in den Patientenproben hohe Spiegel von Immunglobulin M und G beobachtet. Etwa sechs Monate nach der Impfung waren in den Patientenproben signifikant niedrigere Spiegel beider Antikörper vorhanden, die Immunglobulin-M-Spiegel waren jedoch fast vollständig gesunken. 18 Monate nach der Impfung wurden keine Immunglobulin-M-Antikörper in Patientenproben nachgewiesen.
Die Immunglobulin-G-Spiegel blieben bestehen und blieben wie die, die zum Zeitpunkt von sechs Monaten nach dem anfänglichen Rückgang von dem zweiwöchigen Zeitpunkt festgestellt wurden.
