Wir danken dem Wadsworth Center des New York State Department of Health für die Unterstützung dieses Projekts.

Das folgende Protokoll wurde vom Wadsworth Center des New York State Department of Health für die Entwicklung von Assays für die ethische Verwendung von menschlichen Proben genehmigt, Protokollgenehmigungsnummer #03-019.
1. Sicherheit
<ol><li>Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), mindestens Augenschutz (Brille oder Gesichtsschutz), eine chirurgische Maske und latexfreie Handschuhe.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Personal gegen Tollwut geimpft ist und dass innerhalb der letzten 6 Monate ein Titer von ≥0,5 IE/ml nachgewiesen wurde.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Antigen-Objektträgers
HINWEIS: Führen Sie alle Virus-, Liquor- und Serummanipulationen in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) unter Verwendung universeller Vorsichtsmaßnahmen durch.
<ol><li>Bereiten Sie 20 ml Maus-Neuroblastom- oder BHK-21-Zellen auf eine Konzentration von 3,0 x 105 Zellen/ml in den minimal essentiellen Medien von Eagle vor, die mit 10 % fötalem Kälberserum (EGM) ergänzt werden, und lassen Sie sie bis zur Verwendung kalt.</li>
	<li>Bereiten Sie das CVS-11-Virus vor, indem Sie es in EGM auf eine Arbeitsverdünnung von 1,0 x 106,5 50 % infektiöser Gewebekulturdosis (TCID50) pro Milliliter verdünnen und bis zur Verwendung kalt stellen. ANMERKUNG: TCID50 wird nach der zuvor veröffentlichten Reed- und Muench-Methode bestimmt5.</li>
	<li>Reinigen Sie eine Feuchtigkeits-Objektträgerkammer und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichtete Objektträger mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie in der BSC an der Luft trocknen.</li>
	<li>Geben Sie destilliertes Wasser (dH2O) zu saugfähigen Papierstreifen in der Objektträgerkammer, um sicherzustellen, dass die Luftfeuchtigkeit während des gesamten Verfahrens konstant bleibt.</li>
	<li>Beschriften Sie jeden zu verwendenden Objektträger mit einem Bleistift mit der Chargennummer, dem Datum, dem Zellentyp und allen anderen für die Lagerung erforderlichen identifizierenden Informationen und legen Sie sie in die Objektträgerkammer. HINWEIS: Die meisten Marker, Stifte oder Etiketten halten dem zukünftigen Aceton-Fixierungsschritt (Schritt 2.9) nicht stand.</li>
	<li>Tragen Sie 50 μl Virusverdünnung mit einer sich wiederholenden Pipette auf jedes Well auf den Objektträgern auf. Tragen Sie dann 50 μl Zellverdünnung auf jede Vertiefung auf und achten Sie darauf, die Pipettenspitze nicht mit dem Virus zu kontaminieren, das sich bereits auf der Vertiefung befindet.</li>
	<li>Schließen Sie die Feuchte-Objektträgerkammer und stellen Sie sie bei 34-36 °C in den feuchten Inkubator. Beurteilen Sie die Zellinfektiosität nach 24 Stunden. HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.8 bis 2.12 nur auf einer Folie aus.</li>
	<li>Nehmen Sie den Objektträger aus der Feuchtigkeitskammer und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab. Waschen Sie den Objektträger 2 Minuten lang in einem mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllten Coplin-Glas und lassen Sie den Objektträger dann an der Luft trocknen.</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger in das Coplin-Glas und fixieren Sie den Objektträger mindestens 1 Stunde lang in kaltem Aceton in einem Gefrierschrank bei -20 °C, der für brennbare Materialien zugelassen ist. Führen Sie alle Acetongieß- und Lufttrocknungsvorgänge in einem Abzug durch.</li>
	<li>Lassen Sie das Aceton ablüften und trocknen lassen. Tollwut-Direktfluoreszenz-Antikörper-Konjugat (DFA), das gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurde, auf die Vertiefungen des Objektträgers auftragen und 30 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 34-36 °C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie den Objektträger zweimal für jeweils 2 Minuten in Coplin-Gläsern mit PBS. Trocknen Sie die Folie an der Luft.</li>
	<li>Montieren Sie ein Deckglas mit 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) und 20 % Glycerin-Eindeckmittel und lesen Sie den Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung ab, um die Infektiosität zu beurteilen. Wenn die Zellen nicht zu etwa 50 % infiziert sind, wiederholen Sie die Schritte 2.7-2.12 am nächsten Tag, bis die gewünschte Infektiosität erreicht ist. HINWEIS: Die Zellinfektiosität wird auf der Grundlage der visuellen Bewertung des Verhältnisses von negativen Zellen zu tollwutpositiven Zellen auf der Objektträgervertiefung angenähert. Negative Zellen erscheinen rot, während positive Zellen eine grüne Fluoreszenzfärbung aufweisen.</li>
	<li>Entfernen Sie die restlichen Objektträger aus dem Inkubator und der Feuchtigkeitskammer. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung an und legen Sie die Objektträger dann für 1-2 Minuten in ein oder mehrere Coplin-Gläser mit PBS. Lassen Sie die Objektträger ca. 30 Minuten an der Luft trocknen. Lagern Sie die Objektträger bis zur Verwendung bei -80 °C.</li>
</ol>3. Probenvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Verdünnungen von Patientenserum oder Liquorproben für den Test vor. Bereiten Sie das notwendige Konjugat für eine ordnungsgemäße Arbeitskonzentration vor, verdünnt in PBS mit 0,05 % Evansblau. HINWEIS: Bewahren Sie das Konjugat vor der Anwendung im Dunkeln auf, um die Integrität des Fluorophors zu erhalten</li>
</ol>4. IFA-Verfahren
<ol><li>Entfernen Sie die erforderliche Anzahl von vorbereiteten Antigen-Objektträgern, die für jeden Assay benötigt werden, und lassen Sie die Objektträger auftauen und vollständig trocknen.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in ein oder mehrere Coplin-Gläser und fixieren Sie die Objektträger in kaltem Aceton für 2 Stunden bis über Nacht in einem Gefrierschrank bei -20 °C, der für brennbare Materialien zugelassen ist. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Aceton und lassen Sie sie an der Luft trocknen.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammerbox im Inneren des BSC mit dH2O-getränkten Saugstreifen, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Tragen Sie 50 μl jeder Probenverdünnung, Kontrollprobe oder PBS auf die vorbestimmte Vertiefung auf. HINWEIS: Jeder Objektträger muss eine angemessene Anzahl von Patientenproben, Positivkontroll-, Negativkontroll- und PBS-Zellkontroll-Wells enthalten.</li>
	<li>Die geschlossene Feuchte-Objektträgerkammer wird in einen 37 °C warmen, 5 % CO2 -feuchten Inkubator gestellt. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang, nehmen Sie dann die Feuchtigkeitsobjektträgerkammer aus dem Inkubator und legen Sie sie in einen BSC.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Absaugspitze, um den Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung anzusaugen, und stellen Sie sicher, dass die Zellmonoschicht nicht gestört wird. Verwenden Sie eine sterile Tropfpipette, um einen Tropfen PBS auf jede Vertiefung aufzutragen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die sorgfältige Aspiration, legen Sie dann jeden Objektträger in ein mit PBS gefülltes Coplin-Glas und waschen Sie es zweimal für insgesamt 15 Minuten.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger zurück in die Feuchtigkeitskammer und tragen Sie 50 μl geeignetes Anti-Human-Antikörper-Konjugat auf jede Vertiefung auf. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 bis 4.6.</li>
	<li>Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen, montieren Sie ein Deckglas mit Eindeckmedien und lesen Sie die Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop ab.</li>
</ol>5. Analyse der Objektträger
<ol><li>Einstufung der Proben auf der Grundlage des Färbemusters und der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu positiven Kontrollproben mit bestätigtem hohen Antikörpertiter gegen Tollwut.</li>
	<li>Bewerten Sie die Proben auf einer Skala von negativ, 1+, 2+, 3+ und 4+, wobei ein negatives Ergebnis keine Fluoreszenzfärbung zeigt und 4+ eine hellgrüne apfelfarbene Fluoreszenz mit einem Färbemuster ähnlich wie bei positiven Kontrollprobendarstellt 1. HINWEIS: Die Farbe des grünen Apfels gilt nur für FITC-markierte Antikörper. Die Farbe variiert je nach Auswahl des Fluorophors.</li>
	<li>Weisen Sie den Proben einen Endpunktwert zu, der durch den Verdünnungsfaktor dargestellt wird, bei dem die Probe einen Gehalt von 1-2+ aufweist. Testen Sie die Proben mit einem höheren Verdünnungsfaktor, wenn der Endpunkt im ersten Assay nicht erreicht wird.</li>
</ol>

Schneller und frühzeitiger Nachweis von Tollwut-Antikörpern zur Bewertung der Immunantwort bei einem Patienten

<ol>
	<li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1.">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , 232-245 (2018).</li><li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+rabies+serology:+defining+context+of+interpretation.">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516 (2021).</li><li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA)+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera.">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li><li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis.">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies.">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li><li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).</li><li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+(IgA)+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+(MIF)+method:+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit.">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li><li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies:+current+state+and+perspectives.">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li><li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+rabies:+a+literature+review.">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li><li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies-specific+antibodies:+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease.">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der IFA-Test nutzt einen Antigen-Antikörper-Komplex, der eine Markierungsstelle zur Visualisierung tollwutspezifischer Antikörper ermöglicht. Neuroblastom- oder BHK-Zellen werden auf PTFE-beschichtete Objektträger mit mehreren Wells gesetzt und mit dem Tollwutvirus-Laborstamm CVS-11 inokuliert. Sobald die Monoschicht konfluiert ist und die Zellen die gewünschte Infektiosität von ca. 50 % erreicht haben, werden die Objektträger bis zur Gebrauchsbereitschaft gelagert6.
<p class="jove_cont...

Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) dient zum Nachweis verschiedener tollwutspezifischer Antikörper-Isotypen in Seren oder im Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit. Er gehört zu einem Arsenal von Tests, die für die Überwachung eines antemortalen Tollwutpatienten zur Verfügung stehen. Es ist besonders nützlich für die Früherkennung von Antikörpern, um die Immunantwort eines Patienten auf eine Tollwutinfektion zu bewerten. In Verbindung mit anderen Tests, der Anamnese und dem Impfstatus des Patienten kann der IFA-Test bei der Bestimmung der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einem Impfstoff helfen1. Da der IFA-Test IgM und/oder IgG misst, können die Werte des spezifischen Antikörpers einen ungefähren Zeitrahmen von der Exposition gegenüber dem Antigen1 anzeigen. Dieser Test kann in den aufgeführten Anwendungen oder anderen, die noch nicht untersucht wurden, nützlich sein.
Es stehen mehrere serologische Tollwuttests zur Verfügung. Der Fluoreszenz-Fokus-Inhibitions-Schnelltest (RFFIT), der Fluoreszenz-Antikörper-Virus-Neutralisationstest (FAVN) oder deren Modifikationen sind die primären Methoden zur Messung von Tollwutvirus-neutralisierenden Antikörpern (RVNAs)1. Diese Tests unterscheiden jedoch nicht zwischen IgM- und IgG-Antikörpern. Wenn die Differenzierung des Antikörper-Isotyps für die Überwachung der Tollwut-Immunantwort wichtig ist, werden die Tollwut-IFA- und die Tollwut-ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) verwendet, die jedoch keine RVNAs messen. Obwohl die IFA- und ELISA-Tests verwendet werden können, um das Vorhandensein von tollwutspezifischen Antikörpern in einer Probe zu bestimmen, gibt es einige Unterschiede in der Art und Weise, wie sie durchgeführt werden. Der IFA-Test verwendet ein zellkultiviertes lebendes Virus als Antigensubstrat, während ein typischer ELISA für den Tollwutnachweis eines oder mehrere der viralen Proteine verwendet. In einer Laborumgebung, in der das Tollwutvirus kultiviert werden kann, kann der IFA-Test einfacher durchgeführt werden, anstatt einzelne virale Proteine für den ELISA zu kaufen oder zu kultivieren. Der Zweck der Untersuchung und die Informationen, die aus den Ergebnissen eines serologischen Tollwuttests gewonnen werden, sollten bei der Entscheidung berücksichtigt werden, welche zu wählenist 2.
IgM reagiert zuerst und steigt an, bis etwa am 28. Tag ein Klassenwechsel beobachtet wird, an dem IgG zum vorherrschenden zirkulierenden Antikörperwird 3. Daher wäre IgM nur für einen begrenzten Zeitraum nach der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einer Impfung zu erwarten. Die Untersuchung von Serum und Liquor cerebrospinalis (CSF) kann darauf hinweisen, ob die Exposition durch eine Impfung erfolgte, bei der Antikörper nur in Seren zu sehen sind, oder durch eine Virusinfektion, die möglicherweise Antikörper im Liquor1 aufweisen würde.
Es wurde festgestellt, dass Tollwut-Antikörper nach einer Präexpositionsprophylaxe (PrEP) mehrere Jahre persistieren4. Der IFA-Test kann ein nützliches Instrument sein, um dies zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung oder Exposition nachzuweisen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25x55mm glass cover slips</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human IgG Labeled Conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human IgM Labeled Conjugate</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>5230-0286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipette tip</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BION IFA Diluent</td>
			<td>MBL BION</td>
			<td>DIL-9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with FITC filter</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gullsorb IgM inactivation reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-158</td>
			<td>IgG Inactivation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7513</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Media Eagle &#8211; w/Earle&#8217;s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0643</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuroblastoma Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well Teflon coating glass slides</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.6&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3032</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5100, 5500 or 6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride crystals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dropper</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma pre-set crystals pH 9.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9693</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rabies igg and igm antibodies using the rabies indirect fluorescent antibody test

Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) wurde entwickelt, um verschiedene tollwutspezifische Antikörper-Isotypen in Seren oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit nachzuweisen. Dieser Test liefert schnelle Ergebnisse und kann zum Nachweis von Tollwut-Antikörpern in verschiedenen Szenarien verwendet werden. Der Tollwut-IFA-Test ist besonders nützlich für den schnellen und frühen Nachweis von Antikörpern, um die Immunantwort bei einem Patienten, der an Tollwut erkrankt ist, zu bewerten. Obwohl andere Methoden zur antemortalen Tollwutdiagnostik Vorrang haben, kann dieser Test verwendet werden, um eine kürzliche Exposition gegenüber dem Tollwutvirus durch Antikörpernachweis nachzuweisen. Der IFA-Test liefert keinen virusneutralisierenden Antikörpertiter (VNA), aber die Reaktion auf die Präexpositionsprophylaxe (PrEP) kann durch positives oder negatives Antikörpervorhandensein bewertet werden. Dieser Test kann in verschiedenen Situationen eingesetzt werden und Ergebnisse für eine Reihe verschiedener Ziele liefern. In dieser Studie verwendeten wir mehrere gepaarte Serumproben von Personen, die PrEP erhielten und ihre Tollwut-Antikörperpräsenz im Laufe der Zeit mit dem IFA-Test nachweisen konnten.

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test is used to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. It is one of an arsenal of tests available for monitoring an antemortem rabies patient. It is especially useful for the early detection of antibodies to evaluate a patient's immune response to rabies infection. When used in conjunction with other tests, case history, and the patient's vaccination status, the IFA test can assist in determining exposure to rabies virus or a vaccine1. As the IFA test measures IgM and/or IgG, the values of the specific antibody can indicate an approximate time frame from exposure to the antigen1. This test may be useful in the listed applications or others not yet explored.
There are several rabies serological assays available. The rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT), fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) test, or modifications of these are the primary methods for measuring rabies virus neutralizing antibodies (RVNAs)1. However, these tests do not differentiate IgM and IgG antibodies. When differentiating antibody isotype is important in monitoring the rabies immune response, the rabies IFA and the rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tests are used, but they do not measure RVNAs. Although the IFA and ELISA tests can be used to determine the presence of rabies-specific antibodies in a sample, there are some differences in how they are executed. The IFA test utilizes a cell-cultured live virus as its antigen substrate, whereas a typical ELISA for rabies detection uses one or more of the viral proteins. In a laboratory setting where the rabies virus can be cultured, the IFA test may be more easily performed instead of purchasing or cultivating individual viral proteins for the ELISA. The purpose of testing and the information garnered from the results of any rabies serological assay should be considered when determining which to choose2.
IgM is the first to respond, increasing until class switching is observed at around day 28, at which point IgG becomes the predominant circulating antibody3. Hence, IgM would only be expected for a limited amount of time following exposure to rabies virus or vaccination. Testing both serum and cerebrospinal fluid (CSF) can indicate if the exposure was through vaccination, in which antibodies would be seen only in sera, or from a viral infection, which would potentially show antibodies in CSF1.
It has been established that rabies antibodies persist for several years following pre-exposure prophylaxis (PrEP)4. The IFA test can be a useful tool to demonstrate this at different time points following vaccination or exposure.

Autor im Rampenlicht: Nachweis tollwutspezifischer Antikörper-Isotypen in Seren oder zerebraler Rückenmarksflüssigkeit mit einem IFA-Test 

Nachweis von Tollwut-IgG- und IgM-Antikörpern mit dem Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Tollwut-Antikörpern

The IFA test assesses antibody response during rabies infection or evaluates the immune response from vaccines. It can be used to establish antibody presence in a sample and distinguish which antibody isotypes are present. Neutralizing antibody assays are the gold standard for rabies antibody detection to assess antibody titer in a person who has received pre or post-exposure prophylaxis.Although an IFA test may yield different results than a neutralizing antibody assay, it can still provide valuable information when used as an alternative. Typically, assays that measure rabies neutralizing antibodies evaluate immune response. However, these tests take multiple days, requiring virus and live cell culture.The IFA test allows advanced preparation of antigen slides for testing with results in a few hours compared to days. Using the IFA tests in human rabies cases may lead to more answers about how an individual's immune system responds to rabies infection. There is great variation amongst cases, and this test can provide results in a real-time manner during the disease.

Alle Serumproben wurden den Patienten in etwa gleichen Zeiträumen nach der PrEP entnommen. Die Proben wurden von fünf verschiedenen Patienten zu folgenden Zeitpunkten getestet: 2 Wochen nach der letzten Tollwutimpfung, 6 Monate nach der Tollwutimpfserie und 18 Monate nach der Tollwutimpfserie. Jede Serumprobe wurde nacheinander verdünnt und sowohl für das Vorhandensein von IgM als auch für IgG eingestuft, wie in den Protokollschritten 5.2 und 5.3 beschrieben. Der zugewiesene Antikörperwert stellt den Verdünnungsfa...

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Ziel dieses Manuskripts ist es, den Einsatz des indirekten Fluoreszenz-Antikörpertests für Tollwut zum Nachweis von tollwutspezifischen IgG- und IgM-Antikörpern zu untersuchen.

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

Der IFA-Test beurteilt die Antikörperantwort während einer Tollwutinfektion oder bewertet die Immunantwort von Impfstoffen. Es kann verwendet werden, um das Vorhandensein von Antikörpern in einer Probe festzustellen und zu unterscheiden, welche Antikörper-Isotypen vorhanden sind. Neutralisierende Antikörper-Assays sind der Goldstandard für den Nachweis von Tollwut-Antikörpern zur Bestimmung des Antikörpertiters bei einer Person, die eine Prä- oder Postexpositionsprophylaxe erhalten hat.Obwohl ein IFA-Test andere Ergebnisse liefern kann als ein neutralisierender Antikörper-Assay, kann er dennoch wertvolle Informationen liefern, wenn er als Alternative verwendet wird. In der Regel bewerten Assays, die tollwutneutralisierende Antikörper messen, die Immunantwort. Diese Tests dauern jedoch mehrere Tage und erfordern eine Virus- und Lebendzellkultur.Der IFA-Test ermöglicht eine fortschrittliche Vorbereitung von Antigen-Objektträgern für den Test mit Ergebnissen in wenigen Stunden im Vergleich zu Tagen. Die Verwendung der IFA-Tests bei menschlichen Tollwutfällen kann zu weiteren Antworten darüber führen, wie das Immunsystem einer Person auf eine Tollwutinfektion reagiert. Es gibt große Unterschiede zwischen den Fällen, und dieser Test kann während der Krankheit Ergebnisse in Echtzeit liefern.

detection-rabies-igg-igm-antibodies-using-rabies-indirect-fluorescent

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

1.3K Aufrufe.  New York State Department of Health. Der IFA-Test beurteilt die Antikörperantwort während einer Tollwutinfektion oder bewertet die Immunantwort von Impfstoffen. Es kann verwendet werden, um das Vorhandensein von Antikörpern in einer Probe festzustellen und zu unterscheiden, welche Antikörper-Isotypen vorhanden sind. Neutralisierende Antikörper-Assays sind der Goldstandard für den Nachweis von Tollwut-Antikörpern zur Bestimmung des Antikörpertiters bei einer Person, die eine Prä- oder Postexpositionsprophylaxe erhalten h...

Serie: Autor im Rampenlicht: Nachweis tollwutspezifischer Antikörper-Isotypen in Seren oder zerebraler Rückenmarksflüssigkeit mit einem IFA-Test 

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. This test provides rapid results and can be used to detect rabies antibodies in several different scenarios. The rabies IFA test is especially useful for the quick and early detection of antibodies to evaluate the immune response in a patient who has developed rabies. Although other methods for antemortem rabies diagnosis take precedence, this test may be utilized to demonstrate recent rabies virus exposure through antibody detection. The IFA test does not provide a virus-neutralizing antibody (VNA) titer, but the pre-exposure prophylaxis (PrEP) response can be evaluated through positive or negative antibody presence. This test can be utilized in various situations and can provide results for a number of different targets. In this study, we used several paired serum samples from individuals who received PrEP and demonstrated their rabies antibody presence over time using the IFA test.

The aim of this manuscript is to examine the use of the rabies indirect fluorescent antibody test for the detection of rabies-specific IgG and IgM antibodies.