Lösen Sie zunächst Nilrot-Pulver in Aceton mit einer Konzentration von drei Milligramm pro Milliliter auf. Die Lösung wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter regelmäßigem Mischen inkubiert. Filtern Sie die Lösung ein- oder zweimal mit einem 0,22-Mikrometer-Filter, je nachdem, wie viel Niederschlag in der Lösung verbleibt.
Bereiten Sie dann die Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung im Verhältnis eins zu 500 in DPBS verdünnen. Geben Sie 200 Mikroliter der Arbeitslösung in die paraformaldehydfixierten RPE-Zellen und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem lichtgeschützten Schüttler. Waschen Sie die Proben nach der Inkubation zweimal mit DPBS, fügen Sie dann 200 Mikroliter DPBS hinzu und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.
Für die BODIPY-Färbung wird eine 3,8-millimolare Stammkonzentration hergestellt, indem BODIPY in wasserfreiem DMSO aufgelöst wird. Bereiten Sie dann die Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung im Verhältnis eins zu 300 in DPBS verdünnen. 200 Mikroliter der Arbeitslösung von BODIPY zu paraformaldehydfixierten RPE-Zellen geben und über Nacht auf einer Wippe bei Raumtemperatur inkubieren.
Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal mit DPBS und fügen Sie 200 Mikroliter DPBS hinzu, bevor Sie sie bei vier Grad Celsius lagern. Für die APOE-Immunfärbung wird eine Pufferlösung hergestellt, indem DPBS mit 1 % BSA, 0,5 % Tween 20 und 0,5 % Triton X-100 kombiniert wird. Die Paraformaldehyd-fixierten RPE-Zellen werden eine Stunde lang in 200 Mikrolitern Pufferlösung blockiert und permeabilisiert.
Nach der Inkubation wird der APPLE-Primärantikörper in der Pufferlösung mit eins zu 100 verdünnt zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Waschen Sie die Proben am nächsten Tag zweimal mit DPBS. Dann werden 200 Mikroliter Sekundärantikörperlösung, verdünnt bei eins zu 1000, für eine Stunde bei Raumtemperatur zugegeben.
Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit DPBS und fügen Sie 200 Mikroliter DPBS hinzu, bevor Sie sie bei vier Grad Celsius lagern.
