Erstellen Sie mit einem konfokalen Mikroskop und einem 40X-Objektiv ein Scanprofil mit den entsprechenden Fluoreszenzkanälen für den verwendeten Lipidmarker. Nachdem Sie den Aufnahmemodus und die Kanäle eingerichtet haben, optimieren Sie die Fokusstrategie, indem Sie auf Software-Autofokus klicken. Stellen Sie dann den Bereich des Z-Stapels auf 20 Mikrometer ein.
Optimieren Sie anschließend die Kacheln und öffnen Sie den Viewer, um die Kachelpositionen auszuwählen. Erstellen Sie als Nächstes mithilfe einer Batch-Bildverarbeitungsmethode maximale Projektionen jedes Z-Stapels mit der erweiterten Tiefenschärfemethode. Stellen Sie vor dem Exportieren der Bilder die Komprimierung auf "Keine" ein und stellen Sie sicher, dass die Originaldaten überprüft werden.
Das resultierende Bild ist ein maximales Projektions-Graustufen-TIFF nur des Fluoreszenzkanals, der den Lipidmarker exprimiert. Identifizieren Sie die TIFF-Bilder, die entweder Nilrot, BODIPY oder APOE darstellen, und verschieben Sie sie in den Ordner "Bilder" in einem Verzeichnis mit dem Namen Nile Red, BODIPY oder APOE, je nachdem, welche Methode verwendet wird. Öffnen Sie die Software der Lipideinheit.
Wählen Sie auf der Registerkarte Vorhersage das entsprechende Verzeichnis aus, indem Sie auf die Auslassungspunkte klicken und zum benannten Verzeichnis navigieren. Vergewissern Sie sich, dass die Lipideinheit die Bilder korrekt identifiziert hat, indem Sie den Klasseneintrag überprüfen. Klicken Sie auf Vorhersage, um den Aufgabenfortschritt zu beobachten, und durchlaufen Sie dann mit dem Werkzeug "Maskenanalyse" die generierten Masken und geben Sie eine quantitative Zählung der Lipidablagerungen aus den Maskenbildern an.
Die erfolgreiche Differenzierung und Reifung von RPE zeigte eine konfluente Monoschicht mit Pigmentierung und polygonaler Morphologie. Im Gegensatz dazu zeigte die erfolglose Differenzierung Cluster von sterbenden Zellen. In fluoreszierenden Bildern erschienen Nilrot- und BODIPY-Ablagerungen als kleine, helle kreisförmige Punkte.
Ein negatives Ergebnis zeigt eine falsche Bildsegmentierung, indem die Hintergrundfluoreszenz fälschlicherweise als Ablagerung angesehen wird, entweder aufgrund einer schwachen Färbung oder einer hohen Hintergrundintensität. Es werden APOE-Ablagerungen gezeigt, die sich in Größe, Form und Signalintensität unterscheiden und eine Optimierung der Färbe- und Bildgebungsmethoden erfordern, um die Variation zu minimieren.
