Schalten Sie zunächst das Mikroskop, die Lichtquelle, die Kamera und das Absaugsystem ein. Zum Waschen des Perfusionssystems verwenden Sie Ringer-Lösung in der ersten Kammer und Ringer-Zinklösung ergänzt mit Pyrithion in der zweiten Kammer. Nachdem Sie den Wasserhahn geschlossen haben, füllen Sie die Kammern mit den gleichen Lösungen.
Um mit der Probenvorbereitung zu beginnen, platzieren Sie die Perfusionskammer mit der schmalen Seite der Rille nach oben und tragen Sie ein Dichtungssilikon um die Nut auf. Übertragen Sie dann mit einer feinen Pinzette ein 13 Millimeter dickes Deckglas aus der Waschlösung mit den Zellen nach unten auf die Rille. Legen Sie ein 22-Millimeter-Deckglas auf das 13-Millimeter-Deckglas und ziehen Sie es mit der Pinzette fest, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Deckgläser nicht reißen.
Drehen Sie die Kammer um und drücken Sie darauf, um die Flüssigkeiten freizusetzen. Füllen Sie dann die Nut mit 100 Mikrolitern Ringer's Waschlösung und drücken Sie sie erneut, um sicherzustellen, dass keine Leckagen entstehen. Montieren und befestigen Sie die Perfusionskammer auf der Plattform.
Befestigen Sie dann die Perfusions- und Saugschläuche für die Perfusion über den Zellen in der Rinne. Ändern Sie die Perfusionsrate auf etwa zwei Milliliter pro Minute und schalten Sie die Ringer-Lösungsperfusion ein. Öffnen Sie für Messungen die Bildgebungssoftware.
Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops mit der linken Seitentaste des Mikroskops auf 10X ein. Nachdem Sie die Live-Ansicht ausgewählt haben, verwenden Sie den Joystick, um die Plattform zu bewegen und auf die Zellen in der Rille zu fokussieren. Wählen Sie die geeignete Wellenlänge für mCherry aus.
Sobald die Zellen fokussiert sind, verschieben Sie die Plattform für die Auswahl geeigneter Zellfelder. Wählen Sie das Dropdown-Menü ROIs zeichnen aus. Wählen Sie "Kreisförmige ROIs zeichnen" und zeichnen Sie ROIs für Zellcluster mit den mCherry-exprimierenden Zellen.
Erstellen Sie neue ROIs über die erste hinaus, indem Sie die Umschalttaste gedrückt halten und dann die vorhandenen ROIs drücken und ziehen. Wählen Sie ROI für quadratischen Hintergrund zeichnen aus dem Dropdown-Menü und passen Sie die Position und Größe der Hintergrund-ROI an, wenn keine Zellen vorhanden sind. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass im Hintergrund-ROI keine Zellen vorhanden sind, wechseln Sie zur Registerkarte ND-Erfassung.
Wählen Sie die Unterregisterkarte Wellenlänge aus und aktivieren Sie das entsprechende Kontrollkästchen. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen für die GFP-Wellenlänge ebenfalls aktiviert ist. Klicken Sie auf den Unterreiter Zeit und definieren Sie das Messintervall als alle fünf Sekunden und die Dauer als 30 Minuten.
Drücken Sie auf dem Mikroskop die Taste Ein, um das Perfect Focus System (PFS) zu aktivieren. Stellen Sie unter ND-Akquisition sicher, dass PFS ein aktiviert ist. Passen Sie den Fokus an und klicken Sie auf Jetzt ausführen.
Beginnen Sie mit der Messung der Basisperiode für 90 Sekunden mit der Ringer-Lösungsperfusion. Wechseln Sie nach 90 Sekunden von der Ringer-Perfusion zur Ringer-Zinklösungsperfusion und klicken Sie auf die rote Flagge unten rechts auf dem Hauptbedienfeld, sobald der Fluoreszenzanstieg zu sättigen beginnt. Wechseln Sie zurück zur Perfusion mit Ringer-Lösung, bis die Versuchszeit abgelaufen ist.
Um die Daten mit Basisliniensubtraktion zu exportieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Hintergrundkorrektur und zeigen Sie die Änderungen im Fenster ND-Erfassung an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren, um die Daten am gewünschten Speicherort zu speichern. Ein Anstieg der Fluoreszenz resultierte aus einer erhöhten intrazellulären Zinkkonzentration, während eine Abnahme auf die Aktivität von ZnT-1 hindeutete, Zink durch die Zellmembran zu transportieren.
Der Wildtyp ZnT-1 wies eine glattere Fluoreszenzkurve auf als die Mutante, was mit der Variabilität der zellulären Reaktionen auf die Zinkbelastung zusammenhängt. Ein Boxplot, der die Aktivitäten von Wildtyp- und Delta-USCTD verglich, zeigte ähnliche durchschnittliche Transportraten, was auf einen fehlenden Unterschied zwischen dem Wildtyp und der Mutante hindeutet. Der Unterschied in der Ausbreitung kann jedoch auf einen funktionellen Unterschied hinweisen.
