Zentrifugieren Sie die FACS-isolierten Satellitenzellen und verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS, zentrifugieren Sie sie und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang in einem Milliliter kalten Kernextraktionspuffer auf Eis. Geben Sie 20 Mikroliter Concanavalin A-beschichtete Magnetkügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 850 Mikroliter kalten Bindepuffer enthält.
Waschen Sie die Perlen dann mit einem magnetischen Gestell zweimal mit einem Milliliter kaltem Bindepuffer und lassen Sie die Perlen fünf Minuten lang an der Seite des Röhrchens auf dem Gestell ansammeln, bevor Sie sie vorsichtig in 300 Mikroliter kaltem Bindepuffer resuspendieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Kerne und resuspendieren sie vorsichtig in 600 Mikroliter Kernextraktionspuffer. Dann werden 600 Mikroliter extrahierte Kerne mit 300 Mikrolitern Concanavalin-A-Kügelchenaufschlämmung gemischt und 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.
Nach dem Entfernen des Überstandes mit einem magnetischen Gestell werden die perlengebundenen Kerne mit einem Milliliter Kälteschutzpuffer resuspendiert. Entfernen Sie wieder den Überstand und waschen Sie die perlengebundenen Kerne zweimal mit einem Milliliter kaltem Waschpuffer. Trennen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Kernperlenkomplexe vorsichtig mit einem spezifischen Primärantikörper und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren.
Am nächsten Tag wird der Überstand entfernt und die perlengebundenen Kerne gewaschen, bevor sie in 100 Mikrolitern kaltem Waschpuffer resuspendiert werden. Zu den 100 Mikrolitern kügelchengebundenen Kernen werden 100 Mikroliter verdünnte Protein-A-Mikrokokken-Nuklease gegeben und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubiert. Nach der Inkubation wird der Überstand entfernt und die perlengebundenen Kerne zweimal gewaschen, bevor sie in 150 Mikrolitern kaltem Waschpuffer resuspendiert werden.
Als nächstes drei Mikroliter 100 Millimolar Calciumchlorid hinzufügen, schnell durch Schnippen mischen und 30 Minuten auf Eis inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 150 Mikroliter Stopppuffer hinzufügen und 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben und überführen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, wobei Sie das Pellet und die Kügelchen verwerfen.
Dann fügen Sie drei Mikroliter 10%iges Natriumdodecylsulfat und 2,5 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu. Mischen Sie es durch Umkehrung und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Dann fügen Sie 300 Mikroliter Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol und Vortex hinzu, bevor Sie sie in zwei Milliliter-Phase-Lock-Röhrchen umfüllen. Zentrifugieren Sie und geben Sie 300 Mikroliter Chloroform in dasselbe Röhrchen.
Erneut zentrifugieren und den Überstand in einem 1,5 Milliliter Röhrchen auffangen. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter Glykogen hinzu, dann 750 Mikroliter 100%iges Ethanol und lassen die DNA über Nacht bei minus 20 Grad Celsius ausfallen. Am nächsten Tag wird die DNA durch Zentrifugation pelletiert, dann wird das Pellet mit einem Milliliter 100%igem Ethanol gewaschen und zweimal zentrifugiert, bevor das restliche Ethanol mit einer Pipette entfernt wird.
Trocknen Sie das Pellet fünf Minuten lang an der Luft und resuspendieren Sie es in 25 Mikroliter Tris-EDTA-Puffer. Die H3KME2 und H3K27AC wurden um das TSS von PAC7, ITGA7, LAM2, CXCR4 und VCAM1 angereichert. H3K4ME2 und H3K27AC wurden jedoch nicht mit denen von ITGAM, PTPRC, PECAM, CKM oder MHY3 angereichert.
Mit der IgG-Probe wurde fast kein Signal erhalten. HOMER Analyse bekannter Motive, AR-Peaks und Satellitenzellen und prozentual anvisierte Regionen werden gezeigt. Die Sucher-Analyse enthüllte fast 500 Peaks mit einem Peak-Score von mehr als 50, von denen mehr als 200 einen Score von mehr als 100 hatten.
