Zu Beginn wird der anästhesierten Ratte, der zuvor intrazerebroventrikulär der Freisetzungscocktail injiziert wurde, eine Analgesie subkutan verabreicht. Montieren Sie die Ratte auf dem stereotaktischen Rahmen. Befestigen Sie den Kopf mit Ohrbügeln und stellen Sie sicher, dass die Drehbewegung nach vorne und hinten nicht behindert wird.
Stabilisieren Sie den Kopf in einem 40-Grad-Winkel nach unten, um den Nacken richtig zu strecken. Rasieren Sie das Halsfell mit einem Rasierer und desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Runden 10%igem Povidon-Jod und Alkohol mit sterilen Wattestäbchen, wobei Sie jedes Mal drei bis fünf Sekunden lang in verschiedene Richtungen reiben. Identifizieren Sie mit der Fingerspitze den runden deprimierbaren Bereich zwischen dem Hinterhauptsvorsprung und der Wirbelsäule des Atlasses.
Markieren Sie diesen Punkt mit einem Marker. Befestigen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze am stereotaktischen Rahmen. Positionieren Sie die Nadel so, dass sie die Haut an der Markierung berührt.
Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an, während Sie die Spritze durch die Hautschichten einführen. Ziehen Sie den Kolben vorsichtig zurück, um einen Unterdruck in der Spritze zu erzeugen. Führen Sie die Nadel schrittweise ein, bis die Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit in der Spritze sichtbar ist.
Halten Sie die Nadel ruhig an dieser Position und lassen Sie den langsamen Fluss der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit zu. Entfernen Sie die Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit langsam bis zu 120 Mikrolitern. Ziehen Sie die Spritze vorsichtig heraus.
Verabreichen Sie einen Milliliter normales Serum intraperitoneal, um die Flüssigkeitsauffüllung des Versuchstieres zu unterstützen. Kombinieren Sie die Flüssigbiopsie mit 400 Mikrolitern neuralem Stammzellmedium und lagern Sie das Mikrozentrifugenröhrchen für die spätere Verwendung bei vier Grad Celsius. Bringen Sie das Tier dann in den Überwachungsbereich nach der Operation.
Melkbiopsien ergaben neurale Stammzellkulturen mit einem durchschnittlichen Passagepotenzial von 3,17, die sogar neun Passagen erreichten. Die gesammelten Zellen wurden auf Poly-D-Lysin-beschichteten Wells plattiert, wo sie sowohl als adhärente Monolagen als auch seltener als Neurosphären wuchsen. Frisch isolierte Zellen, die GFAP-positiv waren, waren auch immunpositiv für den ruhenden Marker ID3 und wiesen die Charakteristik der bipolaren NSE-Morphologie auf.
Der immunzytochemische Vergleich von Biopsie- und postmortalen Zellen zeigte, dass das Profil der entnommenen Zellen dem der endogenen Zellen der subependymalen Zone ähnelte. Der Wachstumsfaktor führte in beiden Proben zu einem gleichzeitigen und signifikanten Anstieg der SOX2-Zellen und zu einer Abnahme der Doppelcortin-positiven Neuroblasten.
