Stoppen Sie im Behälter des Rührbehälters den pH-Wert und die DO-Kontrolle am Bioreaktorregler vorübergehend und geben Sie das gesamte PBS aus dem Behälter vollständig in die Abfallflasche ab. Schweißen Sie das Einweg-Filtermodul an einen Anschluss des 10-Liter-Einweg-Aufbewahrungsbeutels. Filtern und überführen Sie das komplette serumfreie MSC-Medium in den Aufbewahrungsbeutel.
Stellen Sie die Pumpe um eine Stufe auf 300 U/min ein. Und geben Sie einen Liter Medium aus dem Futterbeutel in das Gefäß. Stoppen Sie die Pumpe.
Und starten Sie die Temperatur pH und lösen Sie sich auf, um erneut gemäß den Anweisungen des Herstellers zu tun. Versiegeln und trennen Sie das Röhrchen, das die Rückmeldung mit dem Zuführrohr verbindet. Schweißen Sie das Rohr von der Flasche mit den dispergierten Mikroträgern an das Zuführrohr.
Und pumpen Sie den gesamten Inhalt aus der Flasche in das Gefäß. Als nächstes werden 2,5 mal 10 auf die acht HMCs in einem serumfreien Medium resuspendiert und in die leere Flasche überführt, die zuvor die Mikroträgersuspension enthielt. Geben Sie serumfreies Medium zu insgesamt 500 Millilitern in die Flasche und mischen Sie die Zellsuspension.
Pumpen Sie den gesamten Inhalt aus der Flasche in das Gefäß. Versiegeln und trennen Sie den Schlauch, der die Flasche mit dem Zuführschlauch verbindet, und schweißen Sie dann den Zuführbeutel wieder zusammen. Passen Sie die Rühreinstellungen am Controller an, um die Zellinokulation zu den Mikroträgern zu initiieren.
Und richten Sie ein automatisiertes Ergänzungs- und Austauschsystem für Medien ein. Schweißen Sie die Einweg-Probenahmebeutel an das Probenahmeröhrchen. Und sammeln Sie Proben zu den gewünschten Zeitpunkten.
Stellen Sie zum Zeitpunkt der Zellernte auf dem Controller die Rührgeschwindigkeit auf Null ein, damit sich die Mikroträger absetzen können. Und geben Sie den Überstand in das Futterregime, wobei etwa ein Liter Kultursuspension im Gefäß verbleibt. Schweißen Sie den Beutel mit 50 Millilitern frisch zubereiteter Aufschlusslösung zur Verdünnung mit 500 Millilitern HBSS zusammen.
Und pumpen Sie die gesamte Lösung über den Zulaufschlauch in den Behälter. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit zwischen 40 und 45 U/min ein, um die Mikroträger aufzulösen. Nachdem sich die Mikroträger innerhalb von 40 bis 60 Minuten aufgelöst haben, schweißt du den Einweg-Drei-Liter-Aufbewahrungsbeutel an das Ernterohr und pumpst die Zellsuspension vollständig ab.
Schalten Sie das Zellverarbeitungssystem während der Zellernte ein. Und installieren Sie ein Einweg-Zellenverarbeitungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers auf dem Instrument. Schweißen Sie die Beutel mit der Zellsuspension, dem Waschpuffer und dem Nährmedium an das Kit.
Geben Sie die Betriebsparameter ein und starten Sie den automatisierten Wasch- und Resuspensionsprozess. Entnehmen Sie die Probe der Zellen aus der Zentrifugenkammer, wie von den Zellverarbeitungssystemen für die Berechnung der Zelldichte angegeben. Stellen Sie nach dem Zählen die Zelldichte unter Verwendung des vollständigen serumfreien Mediums auf zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter ein.
Für den Zellformulierungsprozess in einem 15-Liter-Bioreaktor verwenden Sie Formulierungspuffer, um die geernteten Zellen erneut zu suspendieren. 250 Milliliter resuspendierte Zellen an die Zellfüllung schweißen. Montieren Sie das Einweg-Füll- und Finish-Verbrauchsmaterial-Kit auf dem Zellfüllsystem.
Schalten Sie das Vorkühlsystem ein und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, bevor die Zellen wieder aufgehängt wurden. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem System und stellen Sie es so ein, dass es 30 Milliliter pro Beutel mit insgesamt 20 Beuteln pro Set füllt. Schweißen Sie den neuen Satz von 20 Kryo-Konservierungsbeuteln an das Einweg-Füll- und Finish-Verbrauchsmaterial und wiederholen Sie das Füllen, bis alle Zellen aliquotiert sind.
Für hMSCs wurde eine akkumulative 128-fache Expansion mit einer Zelllebensfähigkeit von über 90 % erreicht. Die Glukoseaufnahme zeigte eine negative Korrelation mit der Zellexpansion, was auf einen Stoffwechsel hindeutet, der mit einem gesunden Zellwachstum verbunden ist. Frisch geerntete MSCs behalten klassische phänotypische Marker mit einer Expression von mehr als 95 % für positive Marker und weniger als 2 % für negative Marker. Die kryokonservierten Zellen zeigten eine gute Adhäsion, ein normales Expansionsverhalten und eine typische Spindelform mit spiralförmigem Wachstum nach dem Auftauen und Umschichten auf 2D-Kolben.
Darüber hinaus behielten die Zellen auch ihre Fähigkeit bei, sich in osteogene, adipogene und chondrogene Linien zu differenzieren. Diese Plattform kann auch für die Kultivierung anderer verankerungsabhängiger Zellen verwendet werden, wie z. B. HEK293T- und Vero-Zellen. Nach dem B2B-Transferprozess im 15-Liter-Bioreaktor erreichten die HEK293T Zellen eine Spitzenzellkonzentration von 1,68 mal 10 der sieben Zellen pro Milliliter.
Während die Vero-Zellen eine Konzentration von 1,08 mal 10 auf die sieben Zellen erreichten. Beide Zelltypen wiesen eine hohe Lebensfähigkeit auf.
