Um mit dem 3D-Druck der phototunbaren Hydrogel-Konstrukte zu beginnen, platzieren Sie die Glasspritze mit der Hydrogel-Biotinte, die Fibroblasten enthält, im Druckkopf und befestigen Sie die Druckkopfkomponenten, während Sie eine feste Montage für den Druck sicherstellen. Passen Sie dann mithilfe der Richtungspfeile in der Pronterface-Software die Position der Extrusionsnadel innerhalb der Stützbadaufschlämmung in der Mitte der Vertiefung der Well-Platte manuell und vorsichtig an. Lassen Sie mindestens einen Millimeter Aufschlämmung unter der Nadelspitze.
Sobald die Nadelspitze richtig platziert ist, drücken Sie die Drucktaste in der Pronterface-Software und warten Sie, bis der Druckvorgang abgeschlossen ist. Wiederholen Sie die zuvor demonstrierten Schritte, bis die gewünschte Anzahl von biogedruckten Konstrukten erreicht ist. Lassen Sie nach dem Drucken die Well-Platte mit den Konstrukten abgedeckt bei Raumtemperatur eine Stunde lang in der Biosicherheitswerkbank stehen.
Dies ermöglicht eine basenkatalysierte Polymerisation mit der phototunbaren Hydrogel-Biotinte. Legen Sie dann die Well-Platte mit den 3D-biogedruckten Konstrukten für 12 bis 18 Stunden in einen sterilen Inkubator bei 37 Grad Celsius, um die Stützbadaufschlämmung zu schmelzen. Wechseln Sie als Nächstes in einer Biosicherheitswerkbank die Medien, die die biogedruckten Konstrukte umgeben.
Entfernen Sie dazu das Medium und das Trägerbad der geschmolzenen Gelatine manuell aus den Vertiefungen, ohne die Konstrukte zu stören. Geben Sie dann ein angemessenes Volumen serumarmarmer Medien in jede Vertiefung. Ersetzen Sie 24 Stunden vor dem gewünschten Versteifungszeitpunkt die Medien in den Vertiefungen durch Medien mit niedrigem Serumgehalt, die mit 2,2 Millimolar sterilem LAP ergänzt wurden.
Entfernen Sie zum gewünschten Versteifungszeitpunkt die Hälfte des Mediums aus den zu versteifenden Vertiefungen und legen Sie die Platte ohne Deckel unter das ultraviolette oder UV-Licht eines OmniCure. Schalten Sie das UV-Licht mit einem 365-Nanometer-Bandpassfilter ein, um die Konstrukte fünf Minuten lang zu versteifen. Entfernen Sie nach der Versteifung das verbleibende Medium aus diesen Vertiefungen, bevor Sie frisches Medium mit niedrigem Serumgehalt in jede Vertiefung geben.
Legen Sie die Platte zurück in den Inkubator, bis die Fibroblastenaktivierungsstudie zum gewünschten Zeitpunkt durchgeführt wird. Die Kombination aus einer sauren Biotinte und einer basischen Trägerbadaufschlämmung erleichterte die Polymerisation der 3D-biogedruckten Konstrukte und behielt die zylindrischen Strukturen bei. Die Mikroskopie des fluoreszenzmarkierten Hydrogels zeigte Poren innerhalb des Hydrogels, die durch Gelatine-Mikropartikel im Trägerbad induziert wurden. Die konfokale Mikroskopie zeigte eine Überversteifung der räumlichen Kontrolle in 3D.
Fibroblasten-Viabilitätstests zeigten, dass Konstrukte mit einer Wandstärke von 300 Mikrometern und 4 Millionen Zellen pro Milliliter alle anderen Bedingungen zu jedem Zeitpunkt übertrafen. Die Lebensfähigkeit erreichte am siebten Tag ihren Höhepunkt, wobei etwa 91 % der Zellen lebend gefärbt waren, und am 14. Tag waren 85 % noch lebensfähig.
