Zu Beginn schneidest du McIntosh-Äpfel mit einem Mandolinenschneider in acht Millimeter dicke Scheiben. Das Hypanthium-Gewebe der Apfelscheiben in fünf mal fünf Millimeter große Quadrate schneiden. Legen Sie die quadratischen Proben zwei Tage lang in 0,1 % SDS, um sie zu dezellularisieren.
Nach der Inkubation werden die Proben mit deionisiertem Wasser gewaschen und über Nacht in 100 Millimolar Calciumchlorid bei Raumtemperatur inkubiert. Sterilisieren Sie diese Gerüste dann 30 Minuten lang in 70%igem Ethanol. Waschen Sie sie mit deionisiertem Wasser und legen Sie sie in eine 24-Well-Kulturplatte.
Verwenden Sie für die Zellaussaat MC3T3-E1 Subklon 4 Zellen, die in mit Zellkulturen behandelten Schalen mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern unter Zellkulturbedingungen aufbewahrt werden. Bereiten Sie auch ein Zellkulturmedium vor, das aus Alpha-MEM besteht, das mit 10 % fötalem Kälberserum oder FBS und 1 % Penicillin in Streptomycin ergänzt wird. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, lösen Sie sie durch Trypsinisierung von den Kulturschalen.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 g für drei Minuten. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in alpha MEM. Als nächstes pipettiert man 40 Mikroliter Aliquot der Zellsuspension auf die Oberfläche der Gerüste und lässt die Zellen eine Stunde lang unter Zellkulturbedingungen haften.
Anschließend werden zwei Milliliter Nährmedium in jede Kulturvertiefung gegeben. Füllen Sie das Nährmedium 14 Tage lang alle zwei bis drei Tage auf. Nach 14 Tagen wird das Differenzierungsmedium durch Zugabe von 50 Mikrogramm pro Milliliter Ascorbinsäure und vier Millimolar Natriumphosphat zum Zellkulturmedium hergestellt.
Geben Sie dieses Medium auf die Kulturplatte. Inkubieren Sie die Gerüste vier Wochen lang, um die Differenzierung der MC3T3-E1-Zellen zu induzieren, und füllen Sie das Medium alle drei bis vier Tage auf.
