Waschen Sie zunächst die dezellularisierten Apfelgerüste mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Zur Messung der Porengröße werden die Gerüste 25 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur in einem Milliliter 10%iger Kalcofluorweißlösung inkubiert. Nachdem Sie die Gerüste mit PBS gewaschen haben, verwenden Sie ein resonantes konfokales Laser-Scanning-Hochgeschwindigkeitsmikroskop und stellen Sie die Konfiguration des Laseremissionsfilters ein.
Stellen Sie die Laserleistung und den Detektor manuell ein, um eine optimale Bildaufnahme zu gewährleisten. Erfassen Sie einen Z-Stapel von 20 Bildern mit einer Schrittweite von fünf Mikrometern. Verwenden Sie als Nächstes in der ImageJ-Software die Funktion "Z-Projekt auf maximale Intensität", um ein Bild zu erstellen, und wenden Sie die Funktion "Kanten suchen" an, um den Rand der Poren hervorzuheben.
Zeichnen Sie die Poren manuell mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug nach. Passen Sie jede Pore als Ellipse an und messen Sie die Länge der Hauptachse. Stellen Sie alle Maße zusammen und berechnen Sie die durchschnittliche Länge.
Für die Analyse der Zellverteilung werden die zellbesiedelten Scaffolds, die in dem entsprechenden Medium kultiviert wurden, nach dreimaligem Waschen mit PBS 10 Minuten lang mit 4%Paraformaldehyd fixiert. Waschen Sie dann jedes Gerüst gründlich mit deionisiertem Wasser, permeabilisieren Sie die Zellen fünf Minuten lang mit einer Triton X-100-Lösung und waschen Sie sie erneut mit PBS. Inkubieren Sie die Gerüste 40 Minuten lang in einem Milliliter 1%iger Periodsäure und spülen Sie sie mit deionisiertem Wasser ab.
Dann inkubieren Sie die Gerüste, indem Sie sie vollständig in einen Milliliter Färbelösung eintauchen. Waschen Sie die Gerüste mit PBS und färben Sie die Zellkerne, indem Sie die Gerüste 10 Minuten lang im Dunkeln in einer DAPI-Lösung mit fünf Milligramm pro Milliliter inkubieren. Waschen Sie die Gerüste noch einmal gründlich und lagern Sie sie in PBS.
Bilden Sie die zellbesiedelten Gerüste mit einem resonanten konfokalen Hochgeschwindigkeits-Laser-Scanning-Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit den hier gezeigten Einstellungen ab. Stellen Sie die Laserleistung und den Detektor manuell ein, um eine optimale Bildaufnahme zu gewährleisten, und erfassen Sie einen Z-Stapel von 20 Bildern mit einer Schrittweite von fünf Mikrometern. Verwenden Sie dann die ImageJ-Software, um die konfokalen Bilder zu verarbeiten, und verwenden Sie die Funktion Z-Projekt auf maximale Intensität, um eine maximale Projektion in der Z-Achse für die Bildanalyse zu erstellen.
Die Quantifizierung der konfokalen Mikroskopiebilder ergab eine Porengrößenverteilung zwischen 73 und 288 Mikrometern mit einem Mittelwert von etwa 154 Mikrometern. Der Großteil der Poren lag zwischen 100 und 200 Mikrometern. Nach der Kultivierung im Differenzierungsmedium wurden Mineralablagerungen in den Gerüsten beobachtet.
Die zellbesiedelten Gerüste wiesen eine undurchsichtige weiße Färbung auf, die auf eine Mineralisierung hindeutet, die in den leeren Gerüsten nicht beobachtet wurde. Darüber hinaus ergab die konfokale Laser-Scanning-mikroskopische Analyse eine homogene Zellverteilung innerhalb der Scaffolds.
