Für den alkalischen Phosphatase-Assay und den Kalziumablagerungs-Assay werden zunächst die aus Äpfeln gewonnenen Gerüste, die in dem entsprechenden Medium kultiviert wurden, dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste 30 Minuten lang mit 10% neutral gepuffertem Formalin. Für den alkalischen Phosphatase-Assay wird eine BCIP/NBT-Färbelösung hergestellt, indem eine BCIP/NBT-Tablette in 10 Milliliter deionisiertem Wasser aufgelöst wird.
Waschen Sie dann die festen Gerüste mit einer 0,05%igen TWEEN-Lösung und färben Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der BCIP/NBT-Lösung. Waschen Sie die Fleckengerüste mit einer 0,05%igen TWEEN-Lösung und lagern Sie sie in PBS. Bilde dann die fleckigen Gerüste mit einer 12-Megapixel-Digitalkamera ab.
Für den Calciumabscheidungsassay wird eine Alizarinrot-S-Färbelösung mit 2 Volumenprozent hergestellt. Waschen Sie dann die festen Gerüste mit entionisiertem Wasser und färben Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit der Lösung Alizarin Red S ein. Waschen Sie die gefärbten Gerüste mit deionisiertem Wasser und lagern Sie sie vor der Bildgebung in PBS.
Bild mit einer 12-Megapixel-Digitalkamera. Um Messungen des Elastizitätsmoduls durchzuführen, entfernen Sie die zellbesiedelten Gerüste aus ihrem jeweiligen Inkubationsmedium und testen Sie die Proben sofort mit einer speziell angefertigten uniaxialen Kompressionsapparatur, die mit einer 1,5-Newton-Wägezelle ausgestattet ist. Komprimieren Sie die Gerüste mit einer konstanten Geschwindigkeit von drei Millimetern pro Minute auf eine maximale Druckdehnung von 10 % der Gerüsthöhe.
Bestimmen Sie den Elastizitätsmodul aus der Steigung des linearen Teils der Spannungs-/Dehnungskurven. Die BCIP/NBT-Färbung ergab einen signifikanten Anstieg der alkalischen Phosphataseaktivität in den zellbesiedelten Scaffolds, die im Differenzierungsmedium kultiviert wurden, im Vergleich zu den zellbesiedelten Scaffolds mit Leer- oder Nicht-Differenzierungsmedium. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Alizarinrot-S-Färbung erzielt, was auf eine größere Kalziummineralisierung in den zellbesiedelten Gerüsten hindeutet, die im Differenzierungsmedium kultiviert wurden.
Der Elastizitätsmodul der zellbesiedelten Gerüste, die im Differenzierungsmedium kultiviert wurden, lag bei etwa 192,0 Kilopascal, was signifikant höher war als bei den zellbesiedelten Scaffolds mit Leer- oder Nicht-Differenzierungsmedium, was auf eine höhere Steifigkeit hindeutet.
