Um das neuartige pumpenlose Mehrkanal-Strömungskultursystem einzurichten, werden nach der Montage des Medienreservoirmoduls (MRM) die Schlauchbaugruppen in das Modul eingesetzt und das MRM in die Heizung eingesetzt. Nachdem Sie die Heizung an Ort und Stelle befestigt haben, fahren Sie mit dem Einsetzen der Gewebekammerbaugruppen oder TCAs in das Perfusionskammermodul oder PCM fort. Setzen Sie mit dem TCA-Einfügewerkzeug jeden der acht TCAs nacheinander in die PCM-Bohrungen ein.
Stellen Sie sicher, dass Sie mit dem Werkzeug fest auf den Adapter drücken, bis die Oberseite der Schlauchhülse um jede Kammer herum die Oberfläche berührt, die die Löcher im PCM umschreibt. Legen Sie das teilmontierte PCM zusammen mit der PCM-Strebe und sechs Schrauben beiseite. 30 Minuten nach der Gehäusemontage und nachdem das MRM die gewünschte Temperatur erreicht hat, wird das voräquilibrierte Perfusat mit einer 50-Milliliter-Pipette in den vorgewärmten MRM-Einsatz überführt, indem die Flüssigkeit vorsichtig an den Seiten verteilt wird.
Um das PCM auf das MRM zu setzen, führen Sie als Nächstes die TCA-Widerstandsröhrchen, die von der Unterseite des PCM ausgehen, in die MRM-Einsätze ein, vier auf jeder Seite des MRM-Teilers. Richten Sie das Modul so aus, dass die Gewebekammern nach der Positionierung am Sauerstoffdetektor anliegen. Befestigen Sie das PCM mit sechs Schrauben und dem elektrischen Schraubendreher an der Stützstrebe.
Befestigen Sie dann die TCAs in den PCM-Stützrippen mit dem mitgelieferten Gummiband und spannen Sie es auf Höhe der Gummidichtungen um die Lamellen. Positionieren Sie den Sauerstoffdetektor auf dem Detektorständer und achten Sie darauf, dass seine Vorderseite an den PCM-Lamellen anliegt. Richten Sie die LED-Photodetektorpaare auf den sauerstoffempfindlichen Farbstoff in den Gewebekammern aus, indem Sie die Schrauben an der Seite des Detektorhalters lösen und bei Bedarf die seitlichen Führungen des Detektors anpassen.
Zum Schluss setzen Sie den Deckel auf das Gehäuse. Um das Gewebe in die Kammern zu laden, warten Sie, bis der Medienstand 0,5 Zoll von der Oberseite entfernt ist. Um die entnommene Netzhaut oder RPE-Aderhaut zu laden, legen Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer feinen Pinzette in jede Kammer, ohne sie zu falten.
Verwenden Sie in der Zwischenzeit ein Tuchtuch, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit der Gewebekammer auf die Sauerstoffsonde tropft. Lassen Sie das Gewebe in Richtung und auf den FRET sinken. Um RPE-Zellen auf Transwell-Membranen zu laden, werden die vorbereiteten Zellen nach der Passage mit 0,25 % Trypsin-EDTA auf Polyethylenterephthalat-Track-Etched-Filter mit einer Porengröße von 0,4 Millimetern gesät.
Am Tag des Experiments werden die Membranen in drei gleich breite Streifen geschnitten und mit einer Pinzette in die Gewebekammern gelegt. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) der Netzhaut war während der Zeit, in der die Testverbindungen injiziert wurden, konstant, was auf eine stabile Gesundheit und Funktion des Gewebes hinweist und die Gültigkeit der Methode unterstützt. In Übereinstimmung mit den Daten, die mit den konventionellen Perfusionsmethoden sowohl für die Netzhaut als auch für die RPE-Aderhaut gewonnen wurden, nahm die OCR als Reaktion auf Oligomycin ab und stieg als Reaktion auf FCCP an.
Die beobachteten Veränderungen der Laktatproduktionsrate oder LPR waren das Gegenteil von denen, die für OCR beobachtet wurden. RPE-Zellen, die bisher noch nicht mit Flow-Systemen analysiert wurden, reagierten mit dieser Methode ähnlich wie RPE-Aderhaut-Sklera.
