Beginnen Sie damit, die menschlichen Tränenproteinproben auf 50 Mikrogramm Protein zu normalisieren. Dann werden 200 Millimolar Dithiothreitol oder DTT zu einer Endkonzentration von 20 Millimolar DTT gegeben, das 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubiert wird. Nach dem Abkühlen der Proteinlösung auf Raumtemperatur werden 400 Millimolar Jodacetamid bis zu einer Endkonzentration von 40 Millimolar zugegeben und dann 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert.
Als nächstes fügen Sie 12 % wässrige Phosphorsäure im Verhältnis eins zu 10 hinzu, was zu einer Endkonzentration von 1,2 % führt. Die Mischung kurz vorziehen, um die Lösung zu vermischen. Fügen Sie den Proteinbindungspuffer im Verhältnis von eins zu sechs hinzu, bevor Sie erneut wirbeln.
Lösen Sie die Kappe der Mikro-Spin-Säule und montieren Sie die Spin-Säule auf ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um den Durchfluss zu sammeln. Geben Sie bis zu 200 Mikroliter angesäuertes Proteinlysatgemisch in die Säule. Zentrifugieren Sie die Säule bei 4000 G für 20 Sekunden.
Als nächstes fügen Sie 150 Mikroliter Proteinbindungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie wie zuvor, um das suspendierte Protein zu waschen. Montieren Sie die Mikrosäule für den Suspensionsfang auf ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie vorsichtig 20 Mikroliter TEAB-Aufschlusspuffer auf den Filter in der Schleudersäule und vermeiden Sie dabei Blasen und Luftspalten.
Verschließen Sie die Mikro-Spin-Säule des Suspensionsfangs sicher, um eine Verdunstung zu verhindern. Eine Stunde bei 47 Grad Celsius in einem Thermomixer ohne Schütteln inkubieren. Eluieren Sie Peptide mit 40 Mikrolitern 50 Millimolar TEAB.
Dann bei 4000 G für 20 Sekunden zentrifugieren. Nun 40 Mikroliter 0,2%ige Ameisensäure zugeben und wie zuvor zentrifugieren. Zum Schluss fügen Sie 35 Mikroliter 0,2%ige Ameisensäure und 50%Acetonitril hinzu, bevor Sie erneut zentrifugieren.
Ziehen Sie die drei Eluenten und trocknen Sie sie mit einer Vakuumzentrifuge. Lagern Sie die Proben nach dem Trocknen bei 80 Grad Celsius für die spätere Analyse. Die datenabhängige Akquisitionssuche ergab insgesamt 1183 plus/minus 118 Proteine in der Suspensions-Trapping-Gruppe und 874 plus/minus 70 Proteine bei 1%FDR in der In-Solution-Gruppe.
Die genontologische Analyse ergab ähnliche Proteome für beide Ansätze mit Hauptfunktion als bindende katalytische Aktivität und molekulare Funktionsregulation.
