Zu Beginn fixieren Sie die Gliedmaßen einer betäubten Maus mit Klebeband. Halten Sie die Haut des Bauches nach oben und schneiden Sie vorsichtig entlang des Umfangs des Brustkorbs, um sie vollständig freizulegen. Machen Sie mit einer Augenschere einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof und führen Sie sofort eine Perfusionsnadel mit 22 Gauge am Scheitelpunkt des linken Ventrikels ein.
Dann drücken Sie 30 bis 50 Milliliter kardiale Perfusionsflüssigkeit durch die Spritze. Nachdem die aus dem rechten Vorhof austretende Flüssigkeit vollständig klar geworden ist, infundiert ein gleiches Volumen von 4%iger PFA-Lösung. Sezieren Sie das Gewebe und die Organe und fixieren Sie sie über Nacht mit 4%PFA bei vier Grad Celsius.
Um die Entkalkung des Gewebes zu induzieren. Das fixierte Herzgewebe wird in 10 Milliliter EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius auf einen Rütteltisch gelegt. Etwa zwei Tage inkubieren und die Flüssigkeit täglich wechseln.
Legen Sie die fixierten Schädelknochen in 20 Milliliter 25%ige Quadrollösung zur Gewebeentfärbung. Einen Tag lang auf einem Rütteltisch bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Flüssigkeit einmal wechseln. Als nächstes legen Sie das Gewebe nacheinander in eine 30%ige Tertiär-Butanol- oder TB-Lösung.
Dann 50 % TB Lösung und dann 70 % TB Lösung, um eine Gradientenentfettung durchzuführen. Anschließend werden die Proben und die TB-PEG-Lösung sechs Stunden lang auf einem Rütteltisch bei 37 Grad Celsius dehydriert. Zum Schluss legen Sie das vollständig dehydrierte Gewebe in BB PEG-Lösung auf einen Schütteltisch bei 37 Grad Celsius.
Nach zwei bis vier Stunden Inkubation wird das Gewebe durchsichtig. Die PEGASOS Tissue Clearing Methode führte zu transparentem Gewebe. Gereinigtes Gewebe mit Whole-Mount-EDU-Färbung zeigte, dass die Markierung effizient und gut konserviert war.
In der Kontrollgruppe waren mehrere EDU-positive Zellen diffus über die Nähte verteilt. Nach einem Tag der Nahterweiterung wurden proliferierende Zellen in der Mitte und an den Rändern der Naht beobachtet. Mit zunehmender Verbreiterung der Naht nahm die Anzahl der proliferierenden Zellen mit der Zeit ab.
Bei den grün markierten Zellen handelte es sich um kleine runde Zellen im Knochenmark, die sich von den EDU-positiven Nahtzellen unterschieden.
