Zu Beginn am Tag Null serumfreies Differenzierungsmedium oder SFD-Medium, das Zytokin Mix 1 enthält, auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Geben Sie dann unter einer sterilen Gewebekulturhaube das mit Zytokinen ergänzte Medium Mix 1 in jede Vertiefung einer zellabweisenden Sechs-Well-Platte. Um die Zellen vorzubereiten, saugen Sie das Kulturmedium aus einer Sechs-Well-Platte ab, die humane induzierte pluripotente STAMMZELLEN oder humane IPS-Zellen enthält.
Waschen Sie sie mit DPBS und saugen Sie das DPBS an. Geben Sie dann das Dissoziationsreagenz zu den Zellen und inkubieren Sie sie eine Minute lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie dieses Dissoziationsreagenz abgesaugt haben, inkubieren Sie die Zellen für weitere drei Minuten bei Raumtemperatur.
Klopfen Sie dann 10 Mal auf die Platte mit den Zellen auf jeder Seite, um die Zellcluster zu lösen. Geben Sie einen Milliliter vorgewärmtes Mix 1 Zytokin-ergänztes SFD-Medium in die Zellen pro Well. Übertragen Sie die Zellcluster mit einer Weidepipette aus jeder Vertiefung in eine Vertiefung der Zellabweisungsplatte, die das Medium mit dem Zytokin Mix 1 enthält.
Nachdem Sie die Platte in den Inkubator eingeführt haben, bewegen Sie sie hin und her sowie von einer Seite zur anderen, um den Inhalt gleichmäßig zu verteilen und für die Bildung von Embryoidkörpern oder EB zu inkubieren. Am nächsten Tag schwenken Sie die zellabweisende Platte, die die EBs enthält, um sie in der Mitte der Vertiefungen zu sammeln. Mit einer Pasteurpipette wird die EB-Suspension aus den Vertiefungen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.
Warten Sie fünf bis 10 Minuten, bis sich die EBs am Boden des Röhrchens abgesetzt haben. Waschen Sie in der Zwischenzeit die zellabweisenden Platten mit sterilem Wasser oder DPBS, um einzelne Zellen oder Ablagerungen zu entfernen. Geben Sie zwei Milliliter Mix 1 Zytokin-ergänztes SFD-Medium in jede Vertiefung der Platte.
Saugen Sie nun vorsichtig den Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen an, ohne die EBs zu lösen. Resuspendieren Sie die EBs im berechneten Volumen des SFD-Mediums, das Mix-1-Zytokin enthält. Geben Sie einen Milliliter EB-Suspension in jede Vertiefung der gewaschenen Zellabweisungsplatte, die bereits zwei Milliliter Medium enthält.
Inkubieren Sie die Platte nach dem Dispergieren der EBs, indem Sie die Platte wie zuvor erwähnt vorsichtig bewegen. Nachdem Sie die EBs in der Mitte der Vertiefungen gesammelt haben, fügen Sie das Chiron an der Seite jedes Wells hinzu und vermeiden Sie den direkten Kontakt mit den Zellen. Inkubieren Sie die Vertiefungen wie zuvor gezeigt. Sammeln Sie an den Tagen drei und sechs der Differenzierung die EBs und führen Sie Medienwechsel durch, wie zuvor für den ersten Tag gezeigt.
Verwenden Sie am dritten Tag SFD-Medium, das mit Mix-3-Zytokinen ergänzt ist, und verwenden Sie am sechsten Tag SFD-Medium, das mit Mix-4-Zytokinen ergänzt ist. Nach dem Sammeln und Absetzen der EBs von der zellabweisenden Platte in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, wie zuvor gezeigt, wird der Überstand abgesaugt und dann ein Milliliter Zelldissoziationsreagenz pro im Röhrchen gesammelter Vertiefung EB hinzugefügt, um die EBs zu resuspendieren. Als nächstes wird ein Milliliter dieser EB-Suspension in jede Vertiefung der mit Wasser gewaschenen Zellabweisungsplatte gegeben.
Nachdem Sie die Platte 10 Minuten lang im Inkubator inkubiert haben, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die EBs in jeder Vertiefung zu dissoziieren, indem Sie vorsichtig nicht mehr als 10 Mal auf und ab pipettieren. Dann fügen Sie fünf Milliliter Waschpuffer pro Vertiefung dissoziierter EBs hinzu. Sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie sie durch ein 40-Mikron-Sieb führen.
Nachdem Sie die Zellen in der filtrierten Suspension gezählt haben, schleudern Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300 g herunter. Resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikroliter Waschpuffer, indem Sie einige Male vorsichtig pipettieren, um sicherzustellen, dass keine Klumpen vorhanden sind. Fahren Sie mit der Isolierung der CD34-positiven Zellen mit einem CD34-Mikrobead-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.
EBs von guter Qualität zeigten am zweiten Tag der Differenzierung eine definierte Kante und erschienen klar und hell, wenn sie unter dem Mikroskop beobachtet wurden. Das Vorhandensein dunklerer Bereiche deutete auf den Zelltod innerhalb der EBs hin. Nach einer Chironbehandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen am zweiten Tag zeigte die Quantifizierung der Anzahl der CD34-positiven Zellen am achten Tag der Differenzierung die Reaktion der Zelllinie auf die Behandlung.
Die Durchflusszytometrie zeigte, dass die CD34-positive Anreicherung mit den magnetischen Beads etwa 85% CD34-positive Zellen lieferte.
