Nach dem Erwerb der langen nicht-kodierenden RNA von Interesse wird der Hybridisierungspuffer zunächst zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Als nächstes lösen Sie die vier optischen Dichtesonden in 160 Mikrolitern mit Diethylpyrocarbonat behandeltem deionisiertem Wasser vom Licht weg auf. Bereiten Sie 200 Mikroliter der Sondenmischung für jede Vertiefung vor und richten Sie eine Reihe von 50, 25, 12,5 und sechs Mikrogramm pro Milliliter ein.
Denaturieren Sie die Sondenmischung fünf Minuten lang bei 73 Grad Celsius. Nehmen Sie eine 12-Well-Zellkulturplatte mit 143 B-Zellen auf sterilen Deckgläsern aus Glas. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es zweimal fünf Minuten lang mit PBS.
Lege die Zellen auf einen Shaker. Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie 200 Mikroliter 100%iges Ethanol in jede Vertiefung und fixieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann das Ethanol, geben Sie 200 Mikroliter 0,1 % Triton X-100 in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie 0,1 % Triton X-100 und waschen Sie es zweimal fünf Minuten lang mit PBS. Als nächstes entfernen Sie PBS, geben 200 Mikroliter zweimal Natrium-Salzcitrat oder SSC-Puffer in jede Vertiefung und inkubieren 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie zwei SSC-Puffer, geben Sie 200 Mikroliter 70%iges Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur.
Das 70%ige Ethanol wird verworfen, dann 200 Mikroliter 85%iges Ethanol in jede Vertiefung gegeben und drei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes verwerfen Sie das 85%ige Ethanol, geben 200 Mikroliter 100%iges Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Danach das 100%ige Ethanol absorbieren und entsorgen und die Vertiefungen trocknen lassen.
Als nächstes werden 200 Mikroliter denaturierte Sondenmischung in jede Vertiefung gegeben und dann über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Am nächsten Tag werden Proben von 37 Grad Celsius entnommen, die Sondenmischung verworfen und 200 Mikroliter 0,4-fach SSC 0,3%Tween 20-Puffer in jede Vertiefung gegeben und zwei Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Entfernen Sie den 0,4-fachen SSC-Puffer von 0,3 % Tween 20.
Geben Sie 200 Mikroliter zweimal SSC 0,1 % Tween 20 Puffer in jede Vertiefung und waschen Sie sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Als nächstes verwerfen Sie den zweifachen SSC 0,1%Tween 20-Puffer. Geben Sie 200 Mikroliter DAPI-Färbelösung hinzu und färben Sie sie 20 Minuten lang im Dunkeln auf einem Schüttler.
Nach dem Färben die DAPI-Lösung verwerfen und zwei Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS waschen. Zum Schluss geben Sie 50 Mikroliter gummihaltiges Eindeckmedium auf den Objektträger und legen Sie das Glasabdeckglas auf, um den Objektträger zu fixieren. Repräsentative SNHG6 FISH-Bilder in humanen Osteosarkomzellen werden gezeigt.
Die mit Cy3 markierte SNHG6-Sonde, die rote Fluoreszenz emittiert, zeigte, dass SNHG6 hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Bei Verwendung einer hohen Sondenkonzentration wurde eine Hintergrundfarbe beobachtet.
