Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschüsse von (1) dem National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) die National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Forschungsprojekte im Rahmen des Budgets der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).

In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Abbildung 1 zeigt das Gesamtprotokoll für RNA FISH; Tabelle 1 enthält die Zusammensetzung aller Lösungen und Tabelle 2 enthält die in diesem Protokoll verwendeten Primersequenzen.
1. Sondenvorbereitung
<ol><li>Identifizieren und erwerben Sie die FASTA-Sequenz einer Ziel-lncRNA von Interesse, z. B. von GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Befolgen Sie die Anweisungen auf der Website, entwerfen Sie die ISH-Sonden online19 und überprüfen Sie die Vorschläge des Designalgorithmus, um die Sonden aufzulisten, die mit dem Cy3-Etikett bestellt werden sollen.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Hybridisierungspuffer bei 37 °C für 2 h im Voraus.</li>
	<li>4 Sonden mit optischer Dichte (OD) werden in 160 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem ddH2O in einer Konzentration von 1 mg/ml lichtfern gelöst. HINWEIS: Die optische Dichte (OD) stellt die Maßeinheit von DNA und RNA dar. Normalerweise ist 1 OD-Einheit = 33 μg/ml DNA.</li>
	<li>Bereiten Sie 200 μl der Sondenmischung für jede Vertiefung vor (1,2 μl-10 μl Sonde, 70 μl Hybridisierungspuffer, bilden Sie das Volumen mit DEPC-behandeltem ddH2O bis 200 μl) und richten Sie eine Reihe von 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml und 6 μg/ml ein. HINWEIS: Die Sondenkonzentration muss im Voraus experimentell untersucht werden. Eine hohe Sondenkonzentration führt zu einer unspezifischen Bindung von lncRNAs, während eine niedrige Sondenkonzentration zu einer unempfindlichen oder fehlgeschlagenen Detektion von lncRNAs führt.</li>
	<li>Die Sondenmischung bei 73 °C 5 min denaturieren. HINWEIS: Wenn die Cy3-markierte DNA-Sonde doppelsträngig ist, denaturieren Sie die Sonde 5 Minuten lang bei 95 °C auf einzelsträngige DNA und kühlen Sie sie dann schnell 2 Minuten lang auf Eis ab.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Säen Sie 50.000 143B-Zellen pro Well auf sterile Glasdeckgläser in einer 12-Well-Zellkulturplatte und inkubieren Sie sie für 24 h (37 °C, 5 % CO2) in DMEM. HINWEIS: Die spezifische Zellzahl, die hier ausgesät wird, variiert mit der Zellgröße, was für die ausgesäten Zellen geeignet ist, um nach 24 Stunden Inkubation einen Zusammenfluss von 50% zu erreichen. Die sterilen Deckgläser aus Glas sind rund, um für die 12-Well-Platte geeignet zu sein.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es 2 x 5 Minuten lang mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). HINWEIS: Bereiten Sie 1x PBS mit DEPC-behandeltem ddH2O vor. PBS ohne DEPC-Behandlung kann nicht verwendet werden, da es RNase enthält. Führen Sie alle folgenden Schritte unter RNase-freien Bedingungen durch.</li>
	<li>Entfernen Sie 1x PBS und fügen Sie 200 μl 100%iges Ethanol in jede Vertiefung hinzu, um es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol, fügen Sie 200 μl 0,1 % Triton X-100 (in 1x PBS) in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. HINWEIS: Die Zeit muss mit der Permeabilisierung von Triton X-100 streng kontrolliert werden und darf nicht zu lang sein.</li>
	<li>0,1% Triton X-100 entfernen und 2 x 5 min mit 1x PBS waschen. HINWEIS: Wenn das Protokoll hier pausiert werden muss, ersetzen Sie das PBS durch 70% Ethanol (Verdünnung von 100% Ethanol mit RNase-freiem ddH2O) und lagern Sie die Probe bei 4 °C für bis zu 3 Monate.</li>
	<li>1x PBS entfernen, 200 μl 2x Natriumsalzcitrat (SSC)-Puffer (Verdünnung von 20x SSC mit RNase-freiem ddH2O) in jede Vertiefung geben und 30 min bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie 2x SSC-Puffer, geben Sie 200 μl 70%iges Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Das 70%ige Ethanol wird verworfen, 200 μl 85%iges Ethanol (Verdünnung von 100% Ethanol mit RNase-freiem ddH2O) in jede Vertiefung gegeben und 3 min bei Raumtemperatur inkubiert.</li>
	<li>Verwerfen Sie das 85%ige Ethanol, geben Sie 200 μl 100%iges Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>100% Ethanol absorbieren und entsorgen; Lassen Sie die Vertiefungen trocknen.</li>
</ol>3. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
<ol><li>In jede Vertiefung werden 200 μl Sondenmischung (denaturiert wie in Schritt 1.5) gegeben und bei 37 °C über Nacht (16-18 h) inkubiert. ANMERKUNG: Es besteht eine starke positive Korrelation zwischen der Hybridisierungstemperatur und der Sondenkonzentration. Um den Hintergrund zu optimieren, sollten daher sowohl die Hybridisierungstemperatur als auch die Sondenkonzentration reduziert werden.</li>
	<li>Am nächsten Tag werden Proben ab 37 °C entnommen und die Sondenmischung verworfen. Geben Sie 200 μl 0,4x SSC/0,3% Tween-20-Puffer in jede Vertiefung (vorgewärmt auf 65 °C) und waschen Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie den 0,4-fachen SSC/0,3 %-Tween-20-Puffer, geben Sie 200 μl 200 μl 2-fachen SSC/0,1 %-Tween-20-Puffer in jede Vertiefung und waschen Sie ihn 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie 2x SSC/0,1% Tween-20-Puffer, fügen Sie 200 μl 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbelösung (1 μg/ml) hinzu und färben Sie es 20 Minuten lang lichtfern.</li>
	<li>Die DAPI-Farbstofflösung entsorgen und mit 1x PBS für 2 min bei Raumtemperatur waschen.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl Eindeckmedium mit Gummi auf den Objektträger und legen Sie das Deckglas auf den Objektträger, um es zu fixieren. HINWEIS: Achten Sie darauf, das Deckglas mit der Zellenseite nach unten auf die Folie zu legen.</li>
	<li>Unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten. HINWEIS: Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Lasermikroskop. Letzteres erzeugt eine höhere Empfindlichkeit und Klarheit der Bildgebung.</li>
</ol>

FISH für lange nicht-kodierende RNA-Lokalisation in humanen Osteosarkomzellen

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression.">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation,+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346.">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li><li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation,+migration,+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells.">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li><li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function.">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li><li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer.">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a/RASSF6+axis.">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li><li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K/AKT+pathway.">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ceRNA+in+cancer:+possible+functions+and+clinical+implications.">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li><li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells.">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy.">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a/b+and+miR-214+in+colorectal+cancer.">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 12 (1), 3 (2019).</li><li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p.">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li><li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p/ULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma.">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82 (2019).</li><li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li><li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids.">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells.">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li><li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples.">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+RNA+FISH+(smFISH)+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs.">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses RNA-FISH-Protokoll kann nicht nur die Lokalisierung von lncRNAs in Zellen nachweisen, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine in Zellen, was auch zum Nachweis der Lokalisation von lncRNAs in paraffineingebetteten Geweben verwendet werden kann. Das spezifische Protokoll in solchen Fällen ist jedoch anders, da die in Paraffin eingebetteten Gewebe entwachst werden müssen21. Dieses experimentelle Verfahren kann in 48- oder 96-Well-Platten angewendet werden, aber 384-We...

Unser Verständnis des menschlichen Genoms hat sich durch die jüngsten Fortschritte in der Ganzgenomtechnologie erheblich erweitert. Etwa 93 % des menschlichen Genoms können in RNAs transkribiert werden, aber nur 2 % der RNAs können in Proteine übersetzt werden. Die restlichen 98 % der RNAs, die keine Proteintranslationsfunktion haben, werden als nicht-kodierende RNA (ncRNA)1 bezeichnet. Als eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) haben lange ncRNAs (lncRNAs), die über 200 Nukleotideenthalten 2, aufgrund ihrer Beteiligung an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen der Zellen, wie z. B. Differenzierung, Zykluskontrolle, Apoptose, Migration und Invasion, zunehmend Aufmerksamkeit erregt 3,4,5. LncRNAs spielen ihre Rolle durch verschiedene Mechanismen, wie z. B. die Regulierung der Chromatinstruktur und der nukleären Genexpression, die Kontrolle des mRNA-Spleißprozesses und die posttranskriptionelle Modifikation6. LncRNAs regulieren das Auftreten, die Entwicklung und die Metastasierung von Malignomen sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranskriptioneller Ebene. Die transkriptionelle Regulation wird im Zellkern durch Beeinflussung der RNA-Transkription durch Bindung an die chromosomalen Strukturen realisiert, während die posttranskriptionelle Regulation im Zytoplasma durch die Kontrolle der Zielgene über einen endogenen kompetitiven RNA-Mechanismus (ceRNA) realisiertwird 5,7,8. CeRNA hat einen neuen Mechanismus der RNA-Interaktion aufgedeckt, nämlich dass lncRNAs wie ein Schwamm wirken können, um miRNAs zu adsorbieren und den miRNA-vermittelten Abbau verwandter Zielgene zu hemmen9. Daher ist die Information über die subzelluläre Lokalisation von lncRNAs, unabhängig davon, ob sich eine bestimmte lncRNA im Zytoplasma oder im Zellkern befindet, wichtig, um ihre biologischen Funktionen zu identifizieren.
Gegenwärtig wird die lncRNA-Lokalisierung hauptsächlich mit zwei Methoden nachgewiesen, eine durch Zellkern-/Zytoplasmafraktions-Isolierungsassay und die andere durch RNA-FISH. Im ersten Fall werden RNAs in der zytoplasmatischen bzw. der nukleären Fraktion extrahiert, und dann wird eine PCR-Amplifikation mit spezifischen lncRNA-Primern durchgeführt, um das Verhältnis von lncRNAs im Zytoplasma und Zellkern nachzuweisen. Der Vorteil dieser Methode ist die Zeiteffizienz, während der Nachteil darin besteht, dass sich die tatsächliche lncRNA-Lokalisierung nicht direkt durch den relativen Anteil der lncRNAs im Zytoplasma und Zellkern widerspiegelt. RNA FISH kann die Lokalisierung von lncRNA in Zellen durch das Design von lncRNA-spezifischen Antisense-Kettensequenzen und anschließender Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen nachweisen10. Die RNA-FISH-Methoden wurden mit Fortschritten in den Sondentechniken und Nachweismethoden verbessert, einschließlich Fluorophor-markierter multipler Oligo-Sondensätze11, LNA-Sonden 12 und verzweigter DNA (bDNA)-Sonden13. RNA FISH kann nicht nur die Lokalisation von lncRNA nachweisen, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine mithilfe von zwei- oder mehrfarbiger Immunfluoreszenz14.
In dieser Arbeit haben wir das detaillierte intrazelluläre Lokalisationsdetektionsprotokoll des lncRNA-Wirtsgens 6 (SNHG6) in Osteosarkomzellen (143B) durch RNA FISH als Beispiel einbezogen. SNHG6 ist eine 600-730 Nukleotid-lncRNA in ihrer reifen gespleißten Form und wurde als neues Onkogen bei verschiedenen menschlichen Krebsarten identifiziert, darunter Darmkrebs, Magenkrebs, klarzelliges Ovarialkarzinom, Osteosarkom und hepatozelluläres Karzinom15,16,17,18. Studien haben die Beteiligung von SNHG6 an biologischen Verhaltensweisen von Krebszellen wie Proliferation, EMT und Autophagie bestätigt und die zytoplasmatische Lokalisation von SNHG6 gezeigt, wo es die Zielgene beeinflussen kann, indem es die miRNAs bindet (schwammt)15,16,17. Dieses detaillierte Detektionsprotokoll der intrazellulären Lokalisierung von SNHG6 durch RNA FISH wird hier vorgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>IC1000</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate-12</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>3513,corning</td>
			<td>Place the coverslips in the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cell line (143B)</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td>osteosarcoma cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>&#160;430790, Corning</td>
			<td>Centrifuge the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>abs7026</td>
			<td>The cells are seeded on the coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td>
			<td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td>
			<td>A10005</td>
			<td>Detect SNHG6 location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>LM-E1141</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>DKT200-2&#160;</td>
			<td>Incubation at different high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td>
			<td>Observation and positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td>
			<td>DHP-9051</td>
			<td>The samples were incubated at 37 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E675004</td>
			<td>Attach the coverslips to the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>TS-8S</td>
			<td>Washing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>188105</td>
			<td>The coverslips is placed on the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600198</td>
			<td>Permeable membrane and nuclear membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypsin (0.25%)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>25200056, Gibco</td>
			<td>trypsin treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600560</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna fluorescence in situ hybridization for long non-coding rna localization in human osteosarcoma cells

Die wichtige Rolle langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs) bei Krebs wurde untersucht, wie z. B. die Regulierung der Proliferation, des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT), der Migration, der Infiltration und der Autophagie von Krebszellen. Die Lokalisationsdetektion von lncRNAs in Zellen kann Aufschluss über ihre Funktionen geben. Durch das Design der lncRNA-spezifischen Antisense-Kettensequenz mit anschließender Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) angewendet werden, um die zelluläre Lokalisierung von lncRNAs zu detektieren. Zusammen mit der Entwicklung der Mikroskopie ermöglichen die RNA-FISH-Techniken nun sogar die Visualisierung der schlecht exprimierten lncRNAs. Mit dieser Methode kann nicht nur die Lokalisierung von lncRNAs allein nachgewiesen werden, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine durch Verwendung von zweifarbiger oder mehrfarbiger Immunfluoreszenz. Hier haben wir das detaillierte experimentelle Vorgehen und die Vorsichtsmaßnahmen von RNA FISH am Beispiel des lncRNA-Wirtsgens 6 (SNHG6) in menschlichen Osteosarkomzellen (143B) aufgenommen, um Forschern, die RNA-FISH-Experimente, insbesondere lncRNA-FISH, durchführen möchten, eine Referenz zu bieten.

Our understanding of the human genome has been greatly expanded by recent advances in whole-genome technology. About 93% of the human genome can be transcribed into RNAs, but only 2% of the RNAs can be translated into proteins; the remaining 98% of RNAs that have no protein translation function are called non-coding RNA (ncRNA)1. As a class of noncoding RNAs (ncRNAs), long ncRNAs (lncRNAs), containing over 200 nucleotides2, have attracted increasing attention due to their involvement in many physiological and pathological processes of the cells, such as differentiation, cycle control, apoptosis, migration, and invasion3,4,5. LncRNAs play their roles through various mechanisms, such as regulating chromatin structure and nuclear gene expression, controlling the mRNA splicing process, and posttranscriptional modification6. LncRNAs regulate the occurrence, development, and metastasis of malignancies at both the transcriptional and posttranscriptional levels. Transcriptional regulation is realized in the nucleus by affecting RNA transcription via binding to the chromosomal structures, while posttranscriptional regulation is realized in the cytoplasm by controlling the target genes via an endogenous competitive RNA (ceRNA) mechanism5, 7, 8. CeRNA has revealed a new mechanism of RNA interaction, namely that lncRNAs can act as a sponge to adsorb miRNAs and inhibit the miRNA-mediated degradation of related target genes9. Therefore, the information regarding the subcellular localization of lncRNAs, whether a specific lncRNA is located in the cytoplasm or nucleus, is important to help identify their biological functions.
At present, lncRNA localization is mainly detected by two methods, one is by nucleus/cytoplasm fraction isolation assay, and the other is by RNA FISH. In the former, RNAs in the cytoplasmic and the nuclear fractions are extracted respectively, and then PCR amplification is performed with specific lncRNA primers to detect the ratio of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. The advantage of this method is time efficiency, while the disadvantage is that the actual lncRNA localization is not directly reflected by the relative proportion of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. RNA FISH can detect lncRNA localization in cells through the design of lncRNA-specific antisense chain sequences followed by labeling with fluorescent dyes10. The RNA FISH methods have been improved with advances in probe techniques and detection methods, including fluorophore-labeled multiple oligo probe sets11, LNA probes12, and branched-DNA (bDNA) probes13. RNA FISH can not only detect the localization of lncRNA, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence14.
In this work, we have included the detailed intracellular localization detection protocol of lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in osteosarcoma cells (143B) by RNA FISH as an example. SNHG6 is a 600-730 nucleotide lncRNA in its mature spliced form and identified as a novel oncogene in diverse human cancers, including colorectal cancer, gastric cancer, ovarian clear cell carcinoma, osteosarcoma, and hepatocellular carcinoma15,16,17,18. Studies have confirmed the involvement of SNHG6 in biological behaviors of cancer cells, such as proliferation, EMT, and autophagy, and shown the cytoplasmic localization of SNHG6 where it may affect the target genes by binding (sponging) the miRNAs15,16,17. This detailed detection protocol of SNHG6 intracellular localization by RNA FISH is presented herein.

Autor im Rampenlicht: RNA FISH zur Lokalisierung von lncRNA-SNHG6 in Osteosarkomzellen 

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung für lange nicht-kodierende RNA-Lokalisierung in menschlichen Osteosarkomzellen

The scope of our research is to provide a detailed RNA FISH protocol that's providing a reference for scientists who want to perform RNA FISH experiments. Our research has established that RNA FISH can be used to localize lncRNA in human osteosarcoma cells. Our protocol provided a comprehensive experimental procedure and the precautions for RNA FISH using lncRNA-SNHG6 in human osteosarcoma cells as a reference.

Es werden repräsentative Bilder von SNHG6 FISH in humanen Osteosarkomzellen gezeigt (Abbildung 2). Die Negativkontrolle wird mit der negativen Ctrl-Sonde behandelt; Die Positivkontrolle wird mit der U6-Sonde 20 behandelt. SNHG6-Sonde und U6-Sonde sind mit Cy3 markiert, das rote Fluoreszenz emittiert. DAPI ist ein Farbstoff, der die DNA färbt und blaue Fluoreszenz aussendet. Dieses Ergebnis zeigt, dass SNHG6 hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist, und diese Inf...

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode der RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Lokalisierung der lncRNAs in humanen Osteosarkomzellen.

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

Der Umfang unserer Forschung besteht darin, ein detailliertes RNA-FISH-Protokoll bereitzustellen, das eine Referenz für Wissenschaftler darstellt, die RNA-FISH-Experimente durchführen möchten. Unsere Forschung hat gezeigt, dass RNA FISH zur Lokalisierung von lncRNA in menschlichen Osteosarkomzellen verwendet werden kann. Unser Protokoll lieferte ein umfassendes experimentelles Verfahren und die Vorsichtsmaßnahmen für RNA FISH unter Verwendung von lncRNA-SNHG6 in menschlichen Osteosarkomzellen als Referenz.

rna-fluorescence-situ-hybridization-for-long-non-coding-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

1.0K Aufrufe.  Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Der Umfang unserer Forschung besteht darin, ein detailliertes RNA-FISH-Protokoll bereitzustellen, das eine Referenz für Wissenschaftler darstellt, die RNA-FISH-Experimente durchführen möchten. Unsere Forschung hat gezeigt, dass RNA FISH zur Lokalisierung von lncRNA in menschlichen Osteosarkomzellen verwendet werden kann. Unser Protokoll lieferte ein umfassendes experimentelles Verfahren und die Vorsichtsmaßnahmen für RNA FISH unter Verwendung von lncRNA-SNHG6 in menschlichen Osteosarkomz...

Serie: Autor im Rampenlicht: RNA FISH zur Lokalisierung von lncRNA-SNHG6 in Osteosarkomzellen 

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), migration, infiltration, and autophagy of cancer cells. Localization detection of lncRNAs in cells can provide insight into their functions. By designing the lncRNA-specific antisense chain sequence followed by labeling with fluorescent dyes, RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be applied to detect the cellular localization of lncRNAs. Together with the development of microscopy, the RNA FISH techniques now even allow for visualization of the poorly expressed lncRNAs. This method can not only detect the localization of lncRNAs alone, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence. Here, we have included the detailed experimental operation procedure and precautions of RNA FISH by using lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in human osteosarcoma cells (143B) as an example, to provide a reference for researchers who want to perform RNA FISH experiments, especially lncRNA FISH.

The present protocol describes a method of RNA fluorescence in situ hybridization to localize the lncRNAs in human osteosarcoma cells.

Forschung

Krebsforschung

RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Localize the lncRNAs in Human Osteosarcoma Cells

To begin, after acquiring the long non-coding RNA of interest, incubate the hybridization buffer at 37 degrees Celsius for two hours. Next, dissolve the four optical density probe in 160 microliters of diethyl pyrocarbonate treated deionized water away from the light. Prepare 200 microliters of the probe mixture for each well, and set up a series of 50, 25, 12.5, and six micrograms per milliliter.Denature the probe mix at 73 degrees Celsius for five minutes. Take a 12-well cell culture plate containing 143B cells on sterile glass cover slips. Remove the medium and wash twice for five minutes with PBS.Place the cells on a shaker. Then remove the PBS and add 200 microliters of 100%ethanol to each well, fixing for 15 minutes at room temperature. Then remove the ethanol, add 200 microliters of 0.1%Triton X-100 to each well, and incubate for 15 minutes at room temperature.Remove 0.1%Triton X-100 and wash two times for five minutes with PBS. Next, remove PBS, add 200 microliters of two times sodium-saline citrate or SSC buffer into each well, and incubate for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Remove two times SSC buffer, add 200 microliters of 70%ethanol into each well, and incubate for three minutes at room temperature.Discard the 70%ethanol, then add 200 microliters of 85%ethanol into each well and incubate for three minutes at room temperature. Next, discard the 85%ethanol, add 200 microliters of 100%ethanol to each well, and incubate for three minutes at room temperature. Afterward, absorb and discard the 100%ethanol and allow the wells to dry.Next, add 200 microliters of denatured probe mixture to each well, then incubate at 37 degrees Celsius overnight. The following day, remove samples from 37 degrees Celsius, discard the probe mixture, and add 200 microliters of preheated 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Remove the 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer.Add 200 microliters of two times SSC 0.1%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Next, discard the two times SSC 0.1%Tween 20 buffer. Add 200 microliters of DAPI staining solution and stain for 20 minutes in the dark on a shaker.After staining, discard the DAPI solution and wash it with PBS for two minutes at room temperature. Lastly, add 50 microliters of mounting medium containing gum to the slide and place the glass cover slip to fix the slide. Representative SNHG6 FISH images in human osteosarcoma cells are shown.SNHG6 probe labeled with Cy3, which emits red fluorescence, showed that SNHG6 is mainly localized in the cytoplasm. A background color was observed when using a high concentration of probe.