Analyzing Protein Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells by Western Blotting

Beginnen Sie mit der Zugabe von zwei Millilitern MCF-7-Zellen, die verschiedene Medikamente enthalten, in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellkulturen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 560 x g für drei Minuten bei vier Grad Celsius.

Dann werden die Zellen zweimal mit vorgekühltem PBS gewaschen und zwischen den Waschgängen drei Minuten lang bei 560 x g zentrifugiert. Geben Sie 50 Mikroliter Lysepuffer zu den gewaschenen Zellen und legen Sie die Probe für 15 Minuten in ein Eisbad. Dann zentrifugiert man die Probe bei 8.550 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammelt die überstehende Proteinprobe.

Kombinieren Sie die Proteinprobe mit dem Ladepuffer im Verhältnis vier zu eins. Anschließend denaturieren Sie die Mischung bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten in einem Metallbad. Anschließend die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen lassen.

Trennen Sie die Proteinprobe mit einer 10%igen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Übertragen Sie die Proteine auf eine 0,22 Mikrometer große PVDF-Membran. Nachdem Sie die Membran mit 5 % BSA blockiert haben, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit den entsprechenden Primärantikörpern.

Am nächsten Tag wird die Membran zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper inkubiert. Entwickeln Sie dann die Membranen mit einer ECL-Chemilumineszenzlösung und nehmen Sie die Bilder mit einem berührungslosen quantitativen Western-Blot-Bildgebungssystem auf. Western Blot zeigte, dass die Behandlung mit Salidrosid die Proteinexpression der pro-apoptotischen Faktoren CC-9, CC-7, CC-3, Bim und Bax förderte, während es die Proteinexpression von anti-apoptotischem BCL-2 hemmte.

Salidrosid schränkte die Verhältnisse von p-PI3K zu PI3K und p-AKT zu AKT deutlich ein. In der Zwischenzeit wurde auch die Proteinexpression von mTOR, HIF-1 alpha und Fox01 deutlich unterdrückt.