Diese Arbeit wurde von der Gesundheitskommission der Provinz Sichuan (120025) unterstützt.

Die für die vorliegende Studie verwendeten MCF-7-Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Zellkultur
<ol><li>Die MCF-7-Zellen werden in einer befeuchteten 5%igen CO2 -Atmosphäre bei 37 °C mit DMEM kultiviert, das 10 % FBS und 1 % Penicillin (10.000 U/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) enthält (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die Zellen, die 90 % des Bodens der Schale bedeckten, wurden für das Experiment verwendet und in die folgenden Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Doxorubicinhydrochloridgruppe (DXR, 5 μM) und Sal-Gruppe (20 μM, 40 μM und 80 μM) oder Kontrollgruppe, LY294002 (10 μM, ein Inhibitor von PI3K), Gruppe Sal (80 μM) und LY294002 Gruppe (10 μM) + Sal (80 μM) (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>2. Zellviabilitäts-Assay
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht27.
<ol><li>Säen Sie MCF-7-Zellen mit einer Dichte von 8 x 104 Zellen/Well in 96-Well-Platten und inkubieren Sie mit Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM und 320 μM) für 24 h oder Sal (20, 40, 80 μM) für 12 h/24 h/36 h/48 h über Nacht, bis die Zellen adhärent sind.</li>
	<li>Nach der Behandlung werden die MCF-7-Zellen 2 h lang mit 10 μl/Well CCK-8-Lösung (siehe Materialtabelle) co-inkubiert. Messen Sie dann die optische Dichte bei 450 nm (OD450) mit einem automatischen Mikroplatten-Reader.</li>
</ol>3. Zellmigration und -invasion
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht35.
<ol><li>Inkubieren Sie 2 ml 5 x 10 6 Zellen/ml, die in 6-Well-Platten ausgesät sind, um 90 % des Bodens der Schale zu bedecken.</li>
	<li>Führen Sie eine lineare Kratzwunde entlang der Mitte der Zellmonoschicht mit einer sterilen Pipettenspitze durch. Erfassen Sie Bilder mit einem optischen Mikroskop bei 0 h, 24 h und 48 h.</li>
	<li>Verwenden Sie die Software Image J, um die Breite der Kratzwunden zu messen.</li>
	<li>Für den Transwell-Assay werden MCF-7-Zellen ohne Serummedium suspendiert und in der oberen Transwell-Kammer mit oder ohne Matrigel vorbeschichtet (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verwenden Sie im Boden der Transwell-Kammer das DMEM-Komplettmedium als chemischen Induktor. Nach 24 Stunden werden die Zellen in der oberen Kammer entfernt und die verbleibenden invasiven und migrantischen Zellen in Methanol35 fixiert.</li>
	<li>Färben Sie die MCF-7-Zellen mit kristallvioletter Lösung (siehe Materialtabelle). Nehmen Sie die Bilder mit einem optischen Mikroskop auf.</li>
</ol>4. Aktivitätsbewertung von Na+-K+-ATPase und Ca 2+-Mg2+-ATPase
<ol><li>Verwenden Sie ein Bicinchoninsäure-Kit (BCA), um die Proteinkonzentration in lysierten MCF-7-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen (siehe Materialtabelle).<ol><li>Proben der lysierten Zellen in ihren entsprechenden Gruppen werden in die 96-Well-Platten gegeben. Danach wird die Arbeitslösung zugegeben, um bei 37 °C für 5 Minuten weiter zu inkubieren. Messen Sie abschließend die Werte von OD636 mit einem multifunktionalen Mikroplatten-Reader.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose und des Zellzyklus
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht31.
<ol><li>Die Zellen werden verdaut und geerntet, um sie in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für eine 20-minütige Färbung mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid (PI) zu resuspendieren (siehe Materialtabelle), und dann die Anzahl der apoptotischen Zellen mit einem Durchflusszytometer zu bestimmen.</li>
	<li>Mischen Sie die resuspendierte Probenlösung mit PI-Lösung für eine 30-minütige Inkubation, gefolgt von der Detektion mit einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>6. DCFH-DA und Fluo-4 AM Fluoreszenzfärbung
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht29.
<ol><li>Inkubieren Sie die MCF-7-Zellen 20 Minuten lang mit einer 10 μM DCFH-DA-Fluoreszenzsonde (siehe Materialtabelle) bei 37 °C. Nach gründlicher Entfernung des überschüssigen DCFH-DA durch dreimaliges Waschen mit PBS wird die Fluoreszenzintensität bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 nm bzw. 525 nm mit einem Fluoreszenzmikroskop getestet.</li>
	<li>Inkubieren Sie die MCF-7-Zellen mit einer 5 μM Fluo-4 AM-Fluoreszenzsondenlösung (siehe Materialtabelle) für 45 Minuten bei 37 °C. Nach dreimaligem Waschen mit PBS werden die Fluoreszenzintensitätswerte bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 nm bzw. 516 nm mit einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt.</li>
</ol>7. Westlicher Fleck
<ol><li>2 ml 5 x 10 6 Zellen/ml Zellsuspensionen, die verschiedene Arzneimittel enthalten, in 6-Well-Platten geben und in einem 37 °C heißen 5%igenCO2-Inkubator 24 h lang kultivieren. HINWEIS: Die Gruppen für die Western-Blot-Analyse wurden wie folgt festgelegt: Kontrollgruppe, LY294002 (10 μM) Gruppe, Sal (80 μM) Gruppe und LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) Gruppe (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die Zellen und der Überstand werden gesammelt und bei 560 × g bei 4 °C für 3 Minuten zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn zweimal mit vorgekühltem PBS. Nach jedem Waschgang zentrifugieren Sie die Zellen bei 560 × g bei 4 °C für 3 min.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl Lysepuffer in die Zellprobe aus Schritt 7.2 für ein 15-minütiges Eisbad. Bei 8550 × g bei 4 °C für 10 min zentrifugieren, um die überstehende Proteinprobe zu entnehmen.</li>
	<li>Nach dem Nachweis der Proteinkonzentration mit einer BCA-Methode wird die Proteinprobe in Schritt 7.3 mit einem Beladungspuffer im Verhältnis 4:1 gemischt, bei 100 °C für 10 min in einem Metallbad denaturiert und auf Raumtemperatur abgekühlt.</li>
	<li>Geben Sie 20 μg der Proteinprobe aus Schritt 7.4 hinzu, trennen Sie die Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten35unter Verwendung von 10 % SDS-PAGE (siehe Materialtabelle) und übertragen Sie sie dann auf 0,22 μm PVDF-Membranen. Nach Blockade mit 5% BSA werden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit den entsprechenden Primärantikörpern inkubiert. HINWEIS: Die verdünnte Konzentration der folgenden Primärantikörper beträgt 1:1.000: gespaltene Caspase-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 und β-Aktin (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Am nächsten Tag werden die Membranen 2 h lang bei 37 °C mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper inkubiert. Entwickeln Sie die Membranen mit einer ECL-Chemilumineszenzlösung und nehmen Sie Bilder mit einem berührungslosen quantitativen Western-Blot-Bildgebungssystem auf (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>8. qRT-PCR
<ol><li>Führen Sie eine Zentrifugation durch, um MCF-7-Zellen bei 560 x g bei 4 °C für 3 Minuten zu sammeln, und fügen Sie 500 μl Puffer RL1 in 5 × 106 Zellen hinzu. Blasen und mischen Sie wiederholt mit einer Pipette, bis keine Zellmassen mehr sichtbar sind. HINWEIS: Puffer RL1 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die Zellhomogenate in Schritt 8.1 werden in die in das Sammelröhrchen eingebettete DNA-Reinigungssäule überführt und bei 8.550 × g bei 4 °C für 2 min zentrifugiert. Entfernen Sie die DNA-Reinigungssäule und lassen Sie den Überstand im Sammelröhrchen. HINWEIS: Die DNA-Reinigungssäule und das Sammelröhrchen sind zwei der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>800 μl Puffer RL2 zu 500 μl des Überstandes aus Schritt 8.2 geben und vorsichtig mischen. HINWEIS: Puffer RL2 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle). Vor Gebrauch 120 ml wasserfreies Ethanol zu 60 ml Puffer RL2 geben.</li>
	<li>700 μl des Gemisches aus Schritt 8.3 werden in die reine RNA-Säule überführt, die in das Sammelröhrchen eingebettet ist, und bei 8.550 × g bei 4 °C für 1 Minute zentrifugiert. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen. HINWEIS: Die reine RNA-Säule ist eine der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 8.4, um das verbleibende Gemisch aus Schritt 8.3 zu verarbeiten.</li>
	<li>500 μl Puffer RW1 in die reine RNA-Säule geben und bei 8.550 × g bei 4 °C 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen. HINWEIS: Puffer RW1 ist eine der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>700 μl Puffer RW2 in die reine RNA-Säule geben und bei 8.550 × g bei 4 °C 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 8.7 einmal. HINWEIS: Puffer RW2 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die reine RNA-Säule wieder in das Sammelröhrchen geben und bei 8550 × g bei 4 °C 2 min zentrifugieren, um den verbleibenden Puffer RW2 zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie die reine RNA-Säule in ein neues Sammelröhrchen und tropfen Sie 100 μl RNase-freiesddH2O, das bei 65 °C vorgewärmt ist, in die Mitte der Membran für die reine RNA-Säule. Bei 25 °C für 2 min aufstellen und die RNA-Lösung durch Zentrifugieren bei 8.550 × g bei 4 °C für 1 min sammeln. HINWEIS: RNase-freies ddH2O ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>4 μl 5x Reaktionspuffer, 1 μl Oligo (dT)18-Primer , 1 μl Random-Hexamer-Primer, 1 μl genspezifischer Primer (siehe Tabelle 1), 1 μl Enzymmischung und 5 μg der RNA-Lösung aus Schritt 8.9 in einen 100 μl 8-Röhrchen-Streifen geben. Ergänzen Sie das Reaktionssystem mit RNase-freiem Wasser auf 20 μl.</li>
	<li>Stellen Sie die Reaktionsbedingungen des Systems wie folgt ein: (1): 95 °C, 30 s, 1 Zyklus; (2): 95 °C, 5 s, 50 Zyklen, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 Zyklus, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; und (4): 42 °C, 30 s, 1 Zyklus. Führen Sie das qRT-PCR-Verfahren aus. ANMERKUNG: Die relativen Expressionsniveaus der Zielgene wurden quantitativ mit der 2−ΔΔCT-Methode 36,37 analysiert. Die Primer-Informationen jedes Gens, das für die qRT-PCR-Analyse verwendet wird, sind in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
</ol>9. Statistische Analyse
<ol><li>Geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an.</li>
	<li>Analysieren Sie die Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mit Hilfe von Grafik- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle) mit einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem Tukey-Test. In dieser Arbeit wurde P < 0,05 als statistisch signifikant definiert.</li>
</ol>

Der Mechanismus von Salidrosid bei der Unterdrückung der Migration und Proliferation von MCF-7-Zellen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Brustkrebs betrifft Menschen jeden Alters und verursacht unkalkulierbare körperliche und seelische Belastungen und einen großen wirtschaftlichen Druck1. Brustkrebs mit seiner von Jahr zu Jahr steigenden Morbidität und Mortalität hat auch weltweite Aufmerksamkeit auf sich gezogen, wenn es darum geht, wirksame pflanzliche Therapien zu finden, die über herkömmliche Behandlungen hinausgehen 4,5. Vielversprechend ist, dass eine große Anz...

Als eine der am häufigsten diagnostizierten Krebsarten und häufigsten bösartigen Erkrankungen zeigen die neuesten Statistiken, dass bis 2020 weltweit 2,3 Millionen Fälle von Brustkrebs aufgetreten sind, was 11,7 % aller Krebsfälle ausmacht1. Häufige Symptome von Brustkrebs sind Brustspannen und -kribbeln, Knoten und Schmerzen in der Brust, Ausfluss aus der Brustwarze, Erosion oder eingesunkene Haut und vergrößerte axilläre Lymphknoten 1,2. Noch alarmierender ist, dass die Zahl der Neuerkrankungen und die Gesamtinzidenz von Brustkrebs jedes Jahr mit einer überwältigenden Rate zunehmen und 6,9 % der krebsbedingten Todesfälle ausmachen1. Derzeit umfasst die Brustkrebsintervention noch hauptsächlich Chemotherapie, Operation, Strahlentherapie und eine umfassende Behandlung. Obwohl die Behandlung die Rezidivrate und die Mortalitätsrate der Patienten wirksam senken kann, führt die langfristige Anwendung der Behandlung häufig zu Multiresistenzen, großflächigem Haarausfall, Übelkeit und Erbrechen sowie zu schweren psychischen und psychischen Belastungen 2,3. Insbesondere das potenzielle Risiko von multiplen Organmetastasen durch Brustkrebs zwingt die Menschen auch dazu, nach neuen pflanzlichen Quellen für die medikamentöse Therapie zu suchen 4,5.
Die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-vermittelte Signalübertragung ist am Wachstum, der Proliferation und dem Überleben von Brustkrebs durch Spleißen beteiligt, das die Expression mehrerer Gene beeinflusst6. Als nachgeschaltetes signalsensitives Protein von PI3K deuten zahlreiche Hinweise darauf hin, dass die Proteinkinase B (AKT) mit dem Säugetier-Target of Rapamycin (mTOR)-Protein koppeln könnte, um Brustkrebs weiter zu erhöhen 7,8,9. Darüber hinaus wurde behauptet, dass die Deaktivierung des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs auch eine Schlüsselkomponente in Medikamenten ist, die die maligne Proliferation hemmen und die Apoptose bei Brustkrebs stimulieren10,11,12. Es ist bekannt, dass eine extreme Hypoxie in der Mikroumgebung des Tumors zu einem massiven Anstieg des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 alpha (HIF-1α) führt, der das Fortschreiten von Brustkrebs weiter verschlechtert13,14,15. Parallel dazu führt die AKT-Stimulation auch zu einer übermäßigen Akkumulation von HIF-1α, wodurch die Apoptose in Brustkrebsproben eingeschränktwird 16,17. Interessanterweise wurde bestätigt, dass die Aktivierung des PI3K-AKT-HIF-1α-Signalwegs an der pathologischen Progression und Metastasierung bei einer Vielzahl von Krebsarten beteiligt ist, darunter Lungenkrebs18, Darmkrebs19, Eierstockkrebs20 und Prostatakrebs21. Neben der Orchestrierung durch HIF-1α wird die Überexpression des Transkriptionsfaktors 1 (FoxO1) auch durch die Stimulation des AKT-Signals ausgelöst, die den Zyklusstillstand und die Hemmung der Apoptose in Brustkrebszellen fördert22,23. Zusammengenommen deuten die oben genannten soliden Beweise darauf hin, dass die Hemmung der Kaskade des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs ein potenzielles neues Ziel für die medikamentöse Therapie bei Brustkrebs sein könnte.
Es wurde allgemein nachgewiesen, dass Salidrosid (Sal) krebshemmende24,25, hypoxiehemmende 26,27,28,29 und immunstärkende pharmakologische Aktivitätenausübt 30. Es ist ein hellbraunes oder braunes Pulver, das leicht in Wasser löslich ist, eine Art Phenylethanoidglykosid ist und eine chemische Strukturformel vonC14H20O7und ein Molekulargewicht von300,331,32 aufweist. Moderne pharmakologische Untersuchungen haben gezeigt, dass Sal die Apoptose von Magenkrebszellen fördern kann, indem es den PI3K-AKT-mTOR-Signalweg hemmt24. Weitere Hinweise deuten auch darauf hin, dass die Unterdrückung des PI3K-AKT-HIF-1α-Signalwegs durch die Behandlung mit Sal zur Apoptose von Krebszellen beitragen kann, indem sie deren Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika erhöht25. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Sal die Zellmigration und -invasion einschränkt und einen Zyklusstillstand verursacht, indem es die Apoptose in den menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zellen fördert33,34. Es bleibt jedoch abzuwarten, ob Sal den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg regulieren und die maligne Proliferation von MCF-7-Zellen hemmen kann. Daher zielte dieses Protokoll darauf ab, die Auswirkungen von Sal auf die MCF-7-Zellmigration, -invasion, den Zellzyklus und die Apoptose über den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg zu untersuchen. Die integrierten Forschungsstrategien, die konventionelle, kostengünstige und unabhängige Experimente umfassen, wie z. B. Zellmigrations- und Invasionsbewertungen, Apoptose und Zellzyklusnachweis durch Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ Fluoreszenzbestimmung usw., können eine Referenz für das Gesamtdesign von Experimenten zur Krebsforschung mit traditioneller Pflanzenmedizin bieten. Der experimentelle Ablauf dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% penicillin/streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC/PI kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>AP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax iD5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#5023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL521A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#15071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bim antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-4-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BS350B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cycle staining kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CCS012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-3</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-7</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#8438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#20750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose culture medium</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-15142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL chemiluminescent solution</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL520B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>164210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxO1 antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>70-GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>BF8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human breast cancer cell line MCF-7</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>CL-0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading buffer</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTOR antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+&#8211;K+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3K antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-PI3K antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative western blot imaging system</td>
			<td>Touch Image Pro</td>
			<td>eBlot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G3330-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S0033S</td>
			<td>DCFH-DA fluorescence probe is included here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salidroside</td>
			<td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td>
			<td>H-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G2003-50T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
			<td>Foregene</td>
			<td>RE-03014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF7018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the pharmacological action and molecular mechanism of salidroside in inhibiting mcf-7 cell proliferation and migration

Salidrosid (Sal) enthält antikarzinogene, antihypoxische und entzündungshemmende pharmakologische Aktivitäten. Die zugrundeliegenden Anti-Brustkrebs-Mechanismen sind jedoch nur unvollständig aufgeklärt. Daher sollte dieses Protokoll das Potenzial von Sal bei der Regulierung des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs bei der malignen Proliferation menschlicher Brustkrebs-MCF-7-Zellen entschlüsseln. Zunächst wurde die pharmakologische Aktivität von Sal gegen MCF-7 mittels CCK-8 und Zell-Scratch-Assays untersucht. Darüber hinaus wurde die Resistenz von MCF-7-Zellen durch Migrations- und Matrigel-Invasions-Assays gemessen. Für Zellapoptose und Zyklusassays wurden MCF-7-Zellen schrittweise mit Annexin V-FITC/PI bzw. Zellzyklus-Färbe-Detektionskits für Durchflusszytometrie-Analysen prozessiert. Die Gehalte an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ wurden mittels DCFH-DA und Fluo-4 AM Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Aktivitäten von Na+-K+-ATPase undCa2+-ATPase wurden mit den entsprechenden kommerziellen Kits bestimmt. Die Protein- und Genexpressionsniveaus in der Apoptose und im PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg wurden mit Hilfe von Western-Blot- bzw. qRT-PCR-Analysen bestimmt. Wir fanden heraus, dass die Sal-Behandlung die Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen mit dosisabhängigen Effekten signifikant einschränkte. In der Zwischenzeit zwang die Sal-Verabreichung auch MCF-7-Zellen auf dramatische Weise dazu, Apoptose und Zellzyklus-Arrest zu durchlaufen. Die Immunfluoreszenztests zeigten, dass Sal die Produktion von ROS und Ca2+ in MCF-7-Zellen beobachtbar stimulierte. Weitere Daten bestätigten, dass Sal die Expressionsniveaus der pro-apoptotischen Proteine Bax, Bim, gespaltener Caspase-9/7/3 und der entsprechenden Gene förderte. Konsequenterweise reduzierte die Sal-Intervention die Expression der Proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α und FoxO1 und ihrer entsprechenden Gene deutlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Sal als potenzielle pflanzliche Verbindung zur Behandlung von Brustkrebs verwendet werden kann, da es die maligne Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen reduzieren kann, indem es den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg hemmt.

As one of the most commonly diagnosed cancers and most common malignancies, the latest statistics indicate that 2.3 million cases of breast cancer emerged around the world by 2020, accounting for 11.7% of all cancer cases1. Common symptoms of breast cancer include breast tenderness and tingling, breast lumps and pain, nipple discharge, erosion or sunken skin, and enlarged axillary lymph nodes1,2. Even more alarming, the number of new cases and the overall incidence of breast cancer continues to increase at an overwhelming rate each year, accounting for 6.9% of cancer-related deaths1. At present, breast cancer intervention still mainly involves chemotherapy, surgery, radiotherapy, and comprehensive treatment. Although treatment can effectively reduce the recurrence rate and mortality rate of patients, long-term treatment application often causes produce multidrug resistance, large-area hair loss, nausea and vomiting, and serious mental and psychological burden2,3. Notably, the potential risk of multiple organ metastases from breast cancer also forces people to seek novel herbal sources of drug therapy4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K)-mediated signaling is implicated in the growth, proliferation, and survival of breast cancer through splicing that affects the expression of multiple genes6. As a downstream signal-sensing protein of PI3K, numerous evidence suggests that protein kinase B (AKT) could couple with the mammalian target of rapamycin (mTOR) protein to further increase breast cancer7,8,9. Moreover, the deactivation of PI3K/AKT/mTOR signaling has also been claimed to be a key component in drugs inhibiting malignant proliferation and stimulating apoptosis in breast cancer10,11,12. It is well known that extreme hypoxia in the tumor microenvironment forces a massive surge in hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1&#945;), which further worsens the progression of breast cancer13,14,15. In parallel, AKT stimulation also leads to excessive accumulation of HIF-1&#945;, limiting apoptosis in breast cancer samples16,17. Interestingly, the activation of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling has been confirmed to be involved in pathologic progression and metastasis in a variety of cancers, including lung cancer18, colorectal cancer19, ovarian cancer20, and prostate cancer21. In addition to being orchestrated by HIF-1&#945;, forked head transcription factor 1 (FoxO1) overexpression is also triggered by AKT signaling stimulation, which promotes cycle arrest and the inhibition of apoptosis in breast cancer cells22,23. Together, the above solid evidence suggests that the inhibition of the cascade of PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling may be a potential novel target for drug therapy in breast cancer.
Salidroside (Sal) has been widely demonstrated to exert anti-cancer24,25, anti-hypoxia26,27,28,29, and immune-enhancing pharmacological activities30. It is a light brown or brown powder that is easily soluble in water, is a type of phenylethanoid glycoside, and has a chemical structure formula of C14H20O7 and a molecular weight of 300.331,32. Modern pharmacological investigations have demonstrated that Sal can promote the apoptosis of gastric cancer cells by restraining PI3K-AKT-mTOR signaling24. Further evidence also suggests that the suppression of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling by Sal treatment may contribute to the apoptosis of cancer cells by enhancing their sensitivity to chemotherapeutic agents25. Evidence also suggests that Sal restricts cell migration and invasion and causes cycle arrest by promoting apoptosis in the human breast cancer MCF-7 cells33,34. However, it remains to be seen whether Sal can regulate PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling and inhibit the malignant proliferation of MCF-7 cells. Therefore, this protocol aimed to explore the effects of Sal on MCF-7 cell migration, invasion, cell cycle, and apoptosis via the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway. The integrated research strategies comprising conventional, low-cost, and independent experiments, such as cell migration and invasion assessments, apoptosis and cell cycle detection by flow cytometry, reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ fluorescence determination, etc., can provide a reference for the overall design of experiments for anti-cancer research with traditional herbal medicine. The experimental process of this study is shown in Figure 1.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der molekularen Mechanismen von Salidrosid bei der Behandlung von Brustkrebs 

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

We focus on exploring active compounds derived from natural products and their potential in treating breast cancer. So specifically we aim to elucidate the pharmacologic effects of salidroside and its molecular mechanisms in combining breast cancer. Currently, reliable experimental techniques are lacking to validate salidroside's molecular targets in treating breast cancer.One significant finding in the field is a potential molecular mechanism of salidroside in enhancing the proliferation and migration of MCF7 cells through the regulation of PI3K/AKT/HIF-1 alpha/FoxO1 signaling. The laboratory's future research directly is to explore the pathophysiological mechanisms underlying breast cancer onset, development, prognosis and outcome. Additionally, we screen for active small molecular drugs derived from natural sources that may add in breast cancer prevention and treatment.

Auswirkungen von Sal auf die Hemmung der übermäßigen Proliferation und die Verzögerung der Wundheilung in MCF-7-Zellen Um das Potenzial von Sal gegen Brustkrebs zu untersuchen, testeten wir zunächst seine krebshemmenden Eigenschaften mit Hilfe von Zellproliferationstoxizität und Scratch-Assays der menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie. Diese Zellen wurden mit einer Konzentrationsreihe von Sal (5-320 μM) für 24 h co-inkubiert, und die Zellproliferation wurde mit einem CCK-8-Assay bewertet. Es...

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine umfassende Strategie zur Bewertung der pharmakologischen Wirkung und des Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen.

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Wir konzentrieren uns auf die Erforschung von Wirkstoffen aus Naturstoffen und ihrem Potenzial bei der Behandlung von Brustkrebs. Konkret wollen wir die pharmakologischen Wirkungen von Salidrosid und seine molekularen Mechanismen bei der Kombination von Brustkrebs aufklären. Derzeit fehlen zuverlässige experimentelle Techniken, um die molekularen Ziele von Salidrosid bei der Behandlung von Brustkrebs zu validieren.Eine wichtige Erkenntnis auf diesem Gebiet ist ein potenzieller molekularer Mechanismus von Salidrosid bei der Verbesserung der Proliferation und Migration von MCF7-Zellen durch die Regulation des PI3K/AKT/HIF-1 alpha/FoxO1-Signalwegs. Die zukünftige Forschung des Labors besteht direkt darin, die pathophysiologischen Mechanismen zu erforschen, die dem Beginn, der Entwicklung, der Prognose und dem Ausgang von Brustkrebs zugrunde liegen. Darüber hinaus suchen wir nach aktiven niedermolekularen Medikamenten aus natürlichen Quellen, die zur Brustkrebsprävention und -behandlung beitragen können.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

908 Aufrufe.  Suining Central Hospital. Wir konzentrieren uns auf die Erforschung von Wirkstoffen aus Naturstoffen und ihrem Potenzial bei der Behandlung von Brustkrebs. Konkret wollen wir die pharmakologischen Wirkungen von Salidrosid und seine molekularen Mechanismen bei der Kombination von Brustkrebs aufklären. Derzeit fehlen zuverlässige experimentelle Techniken, um die molekularen Ziele von Salidrosid bei der Behandlung von Brustkrebs zu validieren.Eine wichtige Erkenntnis auf diesem Gebiet ist ein potenzieller moleku...

Serie: Autor im Rampenlicht: Erforschung der molekularen Mechanismen von Salidrosid bei der Behandlung von Brustkrebs 

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

Forschung

Medizin

Evaluating the Migration and Invasion of Salidroside Treated MCF-7 Cells in a Wound Scratch Assay

To begin, incubate two milliliters of the cultured MCF-7 cells in a six-well plate until 90%confluency. In the grown cell monolayer, create a linear scratch wound down the center using a sterile pipette tip. Then capture the images with an optical microscope at different time intervals.For the transwell assay, suspend MCF-7 cells in a serum-free medium. Then see the cells in the upper transwell chamber, either pre-coded or non-coded with Matrigel. Add DMEM complete medium at the bottom of the transwell chamber to act as a chemical inducer.After 24 hours, remove the cells in the upper chamber and fix the remaining invasive and migrant cells using methanol. Stain the MCF-7 cells using crystal violet solution. Next, image the stained cells with an optical microscope.A dose dependent inhibitory effect of salidroside on cell proliferation was observed, with a 50%decline in cell vitality at 40 micromolar. Further, salidroside could inhibit the vitality of MCF-7 cells over time, with a 50%decrease in MCF-7 cell vitality after 24 hours of co-incubation. The wound-scratch assay showed an inhibitory effect for salidroside treatment on MCF-7 cells.Further, salidroside treatment significantly reduced the undesirable migration and invasion of MCF-7 cells.

Evaluierung der Migration und Invasion von Salidrosid-behandelten MCF-7-Zellen in einem Wundkratz-Assay

Determining Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase Activity in Salidroside Treated MCF-7 Cells

Using a bicinchoninic acid kit, measure the protein concentration of lysed MCF-7 cells following the manufacturer's instructions. Add the lysed cell samples into the corresponding groups in a 96-well plate. Then, add the working solution and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes.Finally, measure the optical density values at 636 nanometers in a functional microplate reader. Salidroside restricted the enzyme vitalities of sodium potassium ATPases and calcium ATPase, indicating its potential role in promoting mitochondrial dysfunction.

Bestimmung der Na+-K+-ATPase- und Ca2+-MG2+-ATPase-Aktivität in Salidrosid-behandelten MCF-7-Zellen

Flow Cytometry Analysis of Apoptosis and the Cell Cycle in Salidroside Treated MCF-7 Cells

To begin, harvest the trypsinized MCF7 cells. Next, stain the PBS suspended cells with an X in five of ITC, and propidium iodide, for 20 minutes. Then determine the number of apoptotic cells using a flow cytometer.For cell cycle analysis, mix the re-suspended cells with propidium iodide solution in a fresh tube, and incubate the mixture for 30 minutes. Then detect the sample using a flow cytometer. Salidroside increased the number of MCF7 cells in the early and late apoptotic stages.Meanwhile, compared with the control group, salidroside treatment also sharply increased the number of cells in the G0 G1 phase, while reducing the proportion of S phase cells.

Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose und des Zellzyklus in Salidrosid-behandelten MCF-7-Zellen

DCFH-DA and Fluo-4 AM Fluorescence Staining of Salidroside Treated MCF-7 Cells

Add 10 micromolar of Dcfh-DA fluorescence probe to MCF7 cells and incubate at 37 degrees Celsius for 20 minutes. After incubation, remove the excess Dcfh-DA by washing the cells three times with PBS. Next, test the fluorescence intensity using a fluorescence microscope and an excitation wavelength of 488 nanometers, and an emission wavelength of 525 nanometers.Incubate the MC7 cells with a five micromolar Fluo-4 AM fluorescent probe solution for 45 minutes at 37 degrees Celsius. After washing the cells three times with PBS, determine the fluorescence intensity using a fluorescence microscope with excitation at 488 nanometers and emission at 516 nanometers. Salidroside significantly enhanced ROS fluorescence signals shown by Dcfh-DA immunofluorescent staining.Consistently, Salidroside intervention also distinctly elevated calcium production, evidenced by Fluo-4 AM immunofluorescent staining.

DCFH-DA und Fluo-4 AM Fluoreszenzfärbung von Salidrosid-behandelten MCF-7-Zellen

Analyzing Protein Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells by Western Blotting

Begin by adding two milliliters of MCF-7 cells containing different drugs into the wells of a six-well plate. Incubate the cell cultures for 24 hours at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Harvest the cells by centrifugation at 560 x g for three minutes at four degrees Celsius.Then wash the cells twice with pre-cool PBS, centrifuging at 560 x g for three minutes between the washes. Add 50 microliters of lysis buffer to the washed cells and place the sample in an ice bath for 15 minutes. Then centrifuge the sample at 8, 550 x g for 10 minutes at four degrees Celsius, and collect the supernatant protein sample.Combine the protein sample with the loading buffer in a four to one ratio. Next, denature the mixture at 100 degrees Celsius for 10 minutes in a metal bath. Then cool the mixture at room temperature.Separate the protein sample using 10%SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Transfer the proteins onto a 0.22 micrometer PVDF membrane. After blocking the membrane with 5%BSA, incubate it with the corresponding primary antibodies overnight at four degrees Celsius.The following day, incubate the membrane with goat anti-rabbit IgG secondary antibody at 37 degrees Celsius for two hours. Then develop the membranes using an ECL chemiluminescence solution and capture the images using a contactless quantitative Western blot imaging system. Western blot showed that salidroside treatment promoted the protein expression of the pro-apoptotic factors CC-9, CC-7, CC-3, Bim, and Bax while it inhibited the protein expression of anti-apoptotic BCL-2.Salidroside prominently limited the ratios of p-PI3K to PI3K and p-AKT to AKT. Meanwhile, the protein expression of mTOR, HIF-1 alpha, and Fox01 was also notably suppressed.

Analyse der Proteinexpression in mit Salidrosid behandelten MCF-7-Zellen mittels Western Blot

Determining Gene Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells Using qRT-PCR

Harvest the MCF-7 cells by centrifugalization at 560-G for three minutes, at four degrees Celsius. Add 500 microliters of buffered RL-1 to five times 10 to the six cells and mix thoroughly until no cell masses are visible. Next, transfer the cell homogenates to a DNA cleaning column embedded in the collection tube.Centrifuge the samples at 85-50-G for two minutes, at four degrees Celsius. After centrifuging, remove the DNA cleaning column, retaining the supernatant in the collection tube. Add 800 microliters of buffer RL-2 and 500 microliters of the supernatant, and mix gently.Next, transfer 700 microliters of the mixture into an RNA-only column embedded in the collection tube. Centrifuge the tube at 8, 550-G for one minute, at four degrees Celsius. Then discard the flow-through in the collection tube.Wash the RNA-only column first with 500 milliliters of buffer RW-1, and then with 700 milliliters of buffer RW-2, by centrifuging for one minute at 8, 550-G, and four degrees Celsius at each wash. After removing the residual RW-2 by centrifuging again, transfer the RNA only column to a new collection tube. Add 100 microliters of RNAs-free deionized water, preheated at 65 degrees Celsius to the center of the membrane in the RNA-only column, and wait for two minutes.Then centrifuge at 8, 550-G for one minute, at four degrees Celsius to collect the RNA solution. Set up the reaction mixture for PCR and then set the PCR reaction conditions of the system. Execute the QRT PCR procedure.QRT PCR showed that cylindricity treatment promoted the gene expression of the pro-apoptotic factors, CC-9, CC-7, CC-3, vim, and vax, while it inhibited the gene expression of anti-apoptotic BCL-2. Further, cylindricide administration reduced the gene expression levels of PI-3K, AKT, M-tor, HIF1-Alpha and Fox-01.