Ernten Sie die MCF-7-Zellen durch Zentrifugalisation bei 560 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie 500 Mikroliter gepuffertes RL-1 bis fünf mal 10 zu den sechs Zellen und mischen Sie gründlich, bis keine Zellmassen mehr sichtbar sind. Als nächstes werden die Zellhomogenate in eine DNA-Reinigungssäule überführt, die in das Sammelröhrchen eingebettet ist.
Zentrifugieren Sie die Proben bei 85-50 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren die DNA-Reinigungssäule und halten Sie den Überstand im Sammelröhrchen. 800 Mikroliter Puffer RL-2 und 500 Mikroliter des Überstandes zugeben und vorsichtig mischen.
Als nächstes werden 700 Mikroliter der Mischung in eine reine RNA-Säule überführt, die in das Sammelröhrchen eingebettet ist. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 8,550 g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Anschließend den Durchfluss im Sammelröhrchen entsorgen.
Waschen Sie die reine RNA-Säule zuerst mit 500 Millilitern Puffer RW-1 und dann mit 700 Millilitern Puffer RW-2, indem Sie bei jedem Waschgang eine Minute lang bei 8, 550 g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nachdem Sie das restliche RW-2 durch erneutes Zentrifugieren entfernt haben, wird die RNA-Only-Säule in ein neues Sammelröhrchen überführt. Geben Sie 100 Mikroliter RNAs-freies, auf 65 Grad Celsius vorgewärmtes deionisiertes Wasser in die Mitte der Membran in der RNA-Nur-Säule und warten Sie zwei Minuten.
Dann zentrifugiert man bei 8,550 g für eine Minute bei vier Grad Celsius, um die RNA-Lösung zu sammeln. Stellen Sie das Reaktionsgemisch für die PCR ein und stellen Sie dann die PCR-Reaktionsbedingungen des Systems ein. Führen Sie das QRT-PCR-Verfahren aus.
Die QRT-PCR zeigte, dass die Cylindrizitätsbehandlung die Genexpression der pro-apoptotischen Faktoren CC-9, CC-7, CC-3, vim und vax förderte, während sie die Genexpression von anti-apoptotischem BCL-2 hemmte. Darüber hinaus reduzierte die Verabreichung von Cylindricid die Genexpression von PI-3K, AKT, M-tor, HIF1-Alpha und Fox-01.
