Bereiten Sie zunächst die vier Blätter Filterpapier vor, die jeweils 12,5 mal 7,5 Zentimeter messen. Stapeln Sie zwei Blätter zusammen und legen Sie den Stapel in den Übertragungspuffer, damit er durchweicht. Legen Sie die PVDF-Membran in 95%iges Ethanol und rühren Sie die Membran eine Minute lang auf einer Wippe.
Erinnern Sie sich an das Ethanol. Tauchen Sie die Membran in den Transferpuffer. Und rühren Sie sich zwei Minuten lang.
Legen Sie dann den Stapel Filterpapier auf eine flache, bewegliche Fläche, z. B. einen großen Deckel, und drücken Sie ihn mit einer Rolle flach. Positionieren Sie die PVDF-Membran vorsichtig mit einem Gelablöser oder einer Pinzette auf dem Stapel. Legen Sie anschließend ein einzelnes Blatt trockenes Filterpapier auf diese Membran und gleiten Sie mit der Walze über das Papier, um überschüssigen Puffer auf der Oberfläche der Membran aufzusaugen.
Heben Sie das obere Filterpapier ab, ohne an der Membran zu reiben. Entnehmen Sie isolierte Faserproben aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf, bevor Sie die Probe zentrifugieren und gründlich resuspendieren. Platzieren Sie einen Mikroliter-Tropfen jeder Probe in der Mitte des dafür vorgesehenen Membranbereichs.
Vermeiden Sie es, die Membran mit der Pipettenspitze zu berühren. Lassen Sie die Probentröpfchen 15 Minuten lang vollständig in die Membran einziehen. Heben Sie dann die Membran mit einem Gelablöser oder einer Pinzette vorsichtig vom feuchten Filterpapierstapel ab.
Legen Sie es auf ein trockenes Blatt Filterpapier und lassen Sie es mindestens fünf Minuten trocknen. Reaktivieren Sie die Membran, nachdem die Probenflecken vollständig weiß geworden sind. Fahren Sie dann mit der Immunmarkierung des Zielproteins fort.
Erfahren Sie, wie Sie die Signalpanel-Intensität verwenden, um die Intensität der MHC-Isoformen und Aktinsignale aus den Dot-Blot-Bildern zu klassifizieren. Die Detektion von starken, mittleren und kleinen Zielproteinen wird durch gesättigte, moderate bzw. schwache Signale angezeigt. Vergleichen Sie zur Identifizierung des Fasertyps zunächst die Ergebnisse der Myosin-Schwerkette IIA und der Myosin-Schwerketten-Eins.
Dokumentieren Sie die Fasern, die nur eine einzige Myosin-Schwerketten-Isoform mit entweder gesättigter oder mittlerer Signalintensität aufweisen. Erfassen Sie die mit Aktin detektierten Fasern und keinen Nachweis von Myosin schwerer Kette eins oder IIA als potentiellen Typ 2X. Wenn ein schwaches Myosin-Schwerketten-Isoformsignal mit einem mäßig entsättigten Aktinsignal vorhanden ist, ist es als nicht identifiziert aufzuzeichnen.
Verwerfen Sie Proben mit schwachen oder unentdeckten Zielproteinen. Fasern, die gesättigte oder moderate Signale sowohl von MHCIIA als auch von MHC1 aufweisen, sollten nicht für die fasertypspezifische Präparation verwendet werden. Bereiten Sie nach der MYO1D-ID Proben vom Typ eins und zwei vor, indem Sie Fasern mit gesättigten oder moderaten Signalen für die jeweilige MHC-Isoform kombinieren.
Verwenden Sie 10 Mikroliter jeder fasertypspezifischen Probe und trennen Sie sie gemäß den Richtlinien des Herstellers auf einem vorgefertigten Gel per SDS-Seite. Verwenden Sie einen Gel-Imager, um die MHC-Zielisoform gemäß dem Protokoll des Herstellers zu erkennen. Vergleichen Sie die Signalintensität jeder MHC-Isoform in allen fasertypspezifischen Proben.
Die Identifizierung des Fasertyps wird durch die korrekte MHC-Isoform bei mittlerer oder gesättigter Signalintensität bestätigt. Die Immunmarkierung des Dot Blots ermöglichte die Identifizierung von Typ-2-Fasern, Typ-1-Fasern und potenziellen Typ-2X-Fasern. Die fasertypspezifischen Proben wurden mit Western Blot und Myosin-Schwerketten-spezifischen Antikörpern validiert.
