Beginnen Sie mit dem Pipettieren von 0,5 Millilitern einer Log-Phase-Kultur von Chlorella vulgaris. Verteilen Sie die Kultur auf einer Tris-Acetat-Phosphat- oder TAP-Agarplatte. Bauen Sie die Kultur fünf Tage lang bei 25 Grad Celsius an.
Als nächstes werden 10 Milliliter ergänzte LB-Brühe mit einer Schleife voller elektroporierter Agrobacterium tumefaciens-Kultur in einem Schüttelkolben geimpft. Den Kolben bei 28 bis 30 Grad Celsius und 250 U/min über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag wird ein Milliliter der Nachtkultur in 50 Milliliter supplementiertes LB eingeimpft. Den Kolben bei 28 bis 30 Grad Celsius und 250 U/min inkubieren.
Zur Co-Kultivierung der Algen- und Bakterienkulturen. Zuerst wird die Agrobakterienkultur in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Das Röhrchen wird bei 4.000 g 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Pipettieren Sie dann den Überstand heraus, um ihn zu entsorgen, und waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Induktionsmedium. Als nächstes geben Sie 25 Milliliter Induktionsmedien auf die Chlorella Vulgaris-Kulturplatte. Die Zellen werden in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt und dann bei 4.000 G 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Nach der Entsorgung des Überstandes wird das Algenzellpellet mit 200 Mikrolitern der Bakteriensuspension vermischt. Schütteln Sie die kombinierte Kultur in einem Rotationsinkkubator bei 21 bis 25 Grad Celsius, also bei 150 U/min für eine Stunde. Verteilen Sie 200 Mikroliter der Mischkultur auf Induktionsmediumplatten, ergänzt mit 15 Millimol Glukose und inkubieren Sie die Platten drei Tage lang im Dunkeln bei 21 bis 25 Grad Celsius.
Nach drei Tagen sammeln Sie die Mikroalgen in einem Kolben mit 10 Millilitern TAP-Medium. Ergänzt mit 20 Milligramm pro Liter Tetracyclin. Den Kolben zwei Tage lang im Dunkeln bei einer Temperatur zwischen 21 und 25 Grad Celsius inkubieren.
500 Mikroliter der Kultur werden auf selektive Medien aufgetragen, die mit 20 Milligramm Tetracyclin pro Liter ergänzt werden. Inkubieren Sie die Platten zwei Tage lang bei 21 bis 25 Grad Celsius im Dunkeln, bevor Sie sie in eine beleuchtete Kammer stellen. Wählen Sie einzelne Kolonien aus der Transformationsplatte aus und streifen Sie sie auf TAP-Agarplatten.
Um eine Kolonie-PCR durchzuführen, geben Sie zunächst ein kleines Volumen der transformierenden Algenzellen in 10 Mikroliter steriles Wasser. Kochen Sie die Lösung 15 Minuten lang bei 98 Grad Celsius. In ähnlicher Weise wird eine weitere PCR-Vorlage zur Bestätigung der Abwesenheit von Agrobacterium in der Probe verarbeitet.
Führen Sie die PCR-Proben auf einem DNA-Agarose-Gel mit einer Leiter durch, um die Größe der resultierenden Fragmente zu überprüfen. Transformierte Kolonien konnten auf Platten wachsen, die Hygromycin mit Cefotaxim enthielten. Die Wildtyp-Kolonien wuchsen nicht auf den Platten.
Es wurden Kolonien erhalten, die bis zu 70 Milligramm pro Liter Cefotaxim resistent waren. Das Kolonie-PCR-Amplikon von pCAMBIA1302 fehlte in den Algenproben. MGFP5G im Amplikon wurde jedoch in allen drei Algenproben nachgewiesen.
Algenkulturen, die wiederholt Subkulturen von Cefotaxim waren, zeigten das Fehlen des Virulenzproteins E2, was auf das Fehlen von Plasmiden hinweist. Es wurde ein signifikanter Unterschied im Algenwachstum der Transformanten und der Wildtyp-Stämme beobachtet. Trotz des geringeren Wachstums wies der Transformant höhere Fluoreszenzwerte auf, wenn er auf die Zelldichte normalisiert wurde.
