Beschriften Sie zunächst zwei neue Faxröhren als gemischte Röhren eins und zwei. Bereiten Sie die Zell- und Antikörpersuspension gemäß der angegebenen Tabelle für die durchflusszytometrische Analyse vor. Nachdem Sie die Röhrchen 30 Minuten lang inkubiert haben, waschen Sie jedes Röhrchen zweimal mit einem Milliliter Färbepuffer.
Zentrifugieren Sie die Wirbelröhrchen bei 200 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wird das Pellet in 500 Mikroliter Färbepuffer resuspendiert. Beschichten Sie die Vertiefungen einer 48-Well-Platte mit 200 bis 500 Mikrolitern FBS und lassen Sie sie eine Stunde lang stehen.
Pipettieren Sie dann 200 bis 500 Mikroliter 10%iges MSC-Medium, nachdem Sie die FBS-Reste entfernt haben. Um die Proben für die Einzelzellsortierung vorzubereiten, pipettieren Sie einen Milliliter FBS in zwei neue Faxröhrchen. Rollen Sie die Röhrchen, um eine gleichmäßige Schicht des FBS auf der Innenfläche des Röhrchens zu erzeugen.
Bereiten Sie die Zelle und die Antikörpersuspension in gemischten Röhrchen eins und zwei gemäß der Tabelle für das Sortierexperiment vor. Anschließend die Röhrchen im Dunkeln für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Waschen mit Färbepuffer zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Anschließend wird das Pellet erneut in 500 Mikroliter Färbepuffer eingelegt und vor dem Sortieren 15 Minuten lang in fünf Mikrolitern DAPI inkubiert. Um die Kompensationsmatrix einzurichten, verwenden Sie die einzelnen Röhrchen zur Fleckenkorrektur. Klicken Sie in der Symbolleiste der Gerätesoftware auf Experiment.
Klicken Sie dann auf Kompensationseinstellungen und anschließend auf Kompensationssteuerelemente erstellen. Klicken Sie anschließend auf ungefärbtes Röhrchen, gefolgt von den Parametern im Zytometer-Dialogfeld. Passen Sie die Spannungen an, indem Sie die Werte für jeden Parameter bearbeiten.
Klicken Sie im Akquisitions-Dashboard auf Laden und dann auf Erwerben. Ziehen Sie das P-1-Gatter auf die Zellenpopulation und wenden Sie es auf alle Kompensationsregler an, um die Spannung und das negative Gatter für jeden Parameter einzustellen. Beladen Sie nun die einzelnen Fleckenausgleichsröhrchen einzeln.
Zeichnen Sie die Daten auf und speichern Sie sie. Wählen Sie das aktuelle Experiment aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf, und wählen Sie Kompensationswerte berechnen aus, gefolgt von Verknüpfen und Speichern. Führen Sie die gemischte Röhre eins aus und zeichnen Sie 10.000 Zellen auf.
Legen Sie die Gatter für die interessierende Grundgesamtheit fest, die mit der richtigen Gating-Strategie sortiert werden soll. Als Nächstes legen Sie eine Sammelplatte in das Gerät und stellen eine Zielzellzahl von 2.500 bis 5.000 Zellen pro Vertiefung ein. Wählen Sie dann die Reinheitsmaske für die Einzelzellensortierung aus.
Sammeln Sie die sortierten Zellpopulationen in einer Sammelvorrichtung und lassen Sie sie für die Dauer des Sortierexperiments auf Eis. Zum Schluss werden die Platten in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator gelegt, um die Kulturen bei 37 Grad Celsius zu halten. Die multiparametrischen Durchflusszytometrie-Assay-Diagramme zeigten keine Expression des FITC-Isotyps von CD 90 FITC-Antikörpern.
Die positive Expression der Marker CD-90 und CD-73 und die negative Expression von CD-45 sind vergleichbar mit der ihrer ungefärbten und FMO-Kontrollen. Die Immunphänotypen zeigten die Markerverteilung aus einer der frühen Passagen mit den von der ISCT empfohlenen Markern und CD-44, wodurch die Elternpopulationen als MSCs bestimmt wurden. Die späten Passageschuppen wurden für die Einzelzellsortierung von hohen und schwachen Expressoren verwendet.
Die postsortierten Zellen, die in der 48-Well-Platte gesammelt wurden, zeigten Adhärenz und Proliferation, wie ihre Elternpopulation. Die postsortierten Zellen differenzierten sich in Gegenwart von adipogenen Wachstumsfaktoren.
