Legen Sie zunächst die Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Nasenschleimhautgewebeschnitte der Ratte auf einen Mikroskoptisch. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, bis das Bild deutlich sichtbar ist. Nehmen Sie das Gewebebild mit 40X auf.
Erhitzen Sie den Citratphosphatpuffer, bis er kocht. Geben Sie dann die Objektträger in den Behälter, nachdem Sie ihn vom Herd genommen haben. Nach acht Minuten Erhitzen bis zum Kochen den Herd für acht Minuten ausschalten und anschließend für sieben Minuten auf mittlere niedrige Hitze umschalten.
Nachdem Sie den Behälter auf natürliche Weise abgekühlt haben, geben Sie die Scheiben in PBS. Verwende einen Entfärbungsstreuer, um die Scheiben fünf Minuten lang zu schütteln. Zeichnen Sie dann mit einem immunhistochemischen Stift einen Kreis um das getrocknete Gewebe.
Fügen Sie den Scheiben vor dem Inkubieren 3%ige Wasserstoffperoxidlösung hinzu. Anschließend die Scheiben wie zuvor zum Waschen in PBS geben. Tragen Sie zum Blockieren 5%iges Ziegenserum innerhalb des markierten Kreises auf.
Nach der Inkubation wird die Blockierungslösung vorsichtig entfernt und ein bis zwei Milliliter FOXP3 in die Gewebeschnitte gegeben. Legen Sie die Scheiben dann in eine feuchte Kammer, um sie über Nacht zu inkubieren. Nachdem Sie die Scheiben in PBS gewaschen haben, tupfen Sie die Scheiben vorsichtig mit Filterpapier trocken.
Geben Sie dann ein bis zwei Milliliter der sekundären Antikörperlösung in die Scheiben. Als nächstes werden die Scheiben in 100 Mikrolitern Tyramid-Signalverstärkungs-Arbeitslösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Waschen Sie die Scheiben nach der Inkubation dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS.
Tragen Sie nun vor der Inkubation ein bis zwei Milliliter DAPI-Färbelösung auf die Scheiben auf. Löschen Sie die Autofluoreszenz, indem Sie die Scheiben vor einer 10-minütigen PBS-Wäsche fünf Minuten lang im Quencher inkubieren. Anschließend mit dem Anti-Fluoreszenz-Quencher versiegeln.
Nehmen Sie die mikroskopischen Bilder der gefärbten Abschnitte unter 20- und 40-facher Vergrößerung auf. Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung der Kontrollratten zeigte gut angeordnete Epithelzellen und Zilien. Die Nasenscheidewandschleimhaut war in der Krankheitsgruppe geschädigt und abgelöst, mit deutlicher Neutrophileninfiltration.
Die Multi-Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass die Expression von ROR Gamma T und TCAM1 in der Krankheitsgruppe erhöht war. FOXP3 wurde jedoch unterexprimiert.
