Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis

Zu Beginn perfundiert Sie die externe Lösung fünf Minuten lang mit sauerstoffhaltiger Kochsalzlösung. Mit einer Pipette 10 Mikroliter der Präparierlösung in eine Petrischale überführen. Verwenden Sie nun Spritzennadeln und ein Mikroskop, um die Gehirne der betäubten etablierten Wildtyp- und Knockout-Fliegen sorgfältig zu sezieren.

Mit einer Pipette wird das vorbereitete Gehirn in eine Aufnahmeschale mit fünf Millilitern externer Lösung überführt. Immobilisieren Sie das Gehirn mit einem Cis-Halter. Nehmen Sie als Nächstes das konfokale Bild jedes Gehirns bei 20x auf.

Verwenden Sie den XYT-Scan-Modus und identifizieren Sie die Neuronen des Pilzkörpers mit einer zusätzlichen 4,5-fachen digitalen Verstärkung. Stellen Sie die Laseranregung auf 488 Nanometer mit einer Laserleistung von 16 Mikrowatt ein, um die GCaMP6m-Emission des gesamten Gehirns zu erfassen. Stellen Sie dann die Scanparameter auf 1400 Geschwindigkeit mit einer Pixelgröße von 256 x 256 Pixeln ein.

Stellen Sie die Erfassungsrate auf 5,3 Hertz ein und nehmen Sie drei Minuten lang auf. Analysieren Sie die Fluoreszenz von fünf bis acht Regionen von Interesse. Bestimmen Sie manuell den Zellkörper von Pilzkörperneuronen als die Region von Interesse.

Verwenden Sie Bild J, um die identifizierten Neuronen zu markieren und ihre Fluoreszenzintensitäten zu messen. Analysieren Sie die Fluoreszenzdaten von GCaMP6m wie gezeigt. Definieren Sie die intrazelluläre Fluoreszenz, die zwischen zwei und 2,5 Standardabweichungen ansteigt, als kleine Spitzen und diejenigen, die um mehr als 2,5 Standardabweichungen ansteigen, als große Spitzen.

Kalziumsignale wurden im Pilzkörper von Fliegen beobachtet. Die cac-Knockdown-Fliegen zeigten mehr große Stacheln als kleine Stacheln.