Verwenden Sie zunächst einen Inkubator und einen LED-Mikroplatten-Illuminator, um einen Leuchtkasten zur Steuerung der Lichtexposition und der Temperatur zu erstellen. Positionieren Sie dann eine Sechs-Well-Platte auf der oberen Ablage des Inkubators und prüfen Sie, ob der Lichtstrahl sie gleichmäßig umgibt. Verwenden Sie ein Blatt Papier, um die Verteilung der Lichtabdeckung zu visualisieren.
Verwenden Sie einen Belichtungsmesser, um die Bestrahlungsstärke und die räumliche Gleichmäßigkeit zu messen. Stellen Sie mindestens einen Tag vor der Injektion Injektionsschalen und Agarose-beschichtete Sechs-Well-Platten her. Spülen Sie eine Spritzgießform mit Embryonalmedium aus und legen Sie sie vorsichtig auf die Häutung und Agarose.
Sobald die Agarose fest geworden ist, verwenden Sie vorsichtig die Lasche, um die Form zu entfernen. Als nächstes bereiten Sie geflammte Glaspipetten für Immunfluoreszenzexperimente an dechlorierten Embryonen vor. Legen Sie das Ende einer Glaspipette in eine Brötchen- und Brennerflamme und drehen Sie es kontinuierlich, bis die Ränder glatt werden.
Stellen Sie eine Injektionsmischung mit den hier gezeigten mRNAs her. Für den Phänotypisierungsassay wird die Nadel durch das Corion direkt in die Mitte der Zelle im Ein-Zell-Stadium eingeführt und ein Nanoliter der Injektionsmischung injiziert. Wenn Sie einen Immunfluoreszenz-Assay durchführen, zielen Sie auf das Zentrum der Zelle von beschichteten Embryonen im Ein-Zell-Stadium.
Für beide Assays ist genügend Embryonen für die nicht exponierten, nicht injizierten, nicht exponierten injizierten, exponierten, nicht injizierten und exponierten injizierten Embryonen vorzubereiten. Wählen Sie mindestens 30 Embryonen pro Bedingung aus. Für den Immunfluoreszenz-Assay wird eine zusätzliche Schale mit nicht injizierten Embryonen als Proxy vorbereitet, um das Fortschreiten der Entwicklungsstadien zu beurteilen.
Nach der Injektion werden die Embryonen in Petrischalen bei 28 Grad Celsius inkubiert.
