Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Für den Phänotypisierungs-Assay führen Sie das Lichtexpositionsexperiment an bOpto-BMP-bOpto-Nodal-exprimierenden Zebrafischembryonen durch und entfernen Sie sie einen Tag nach der Befruchtung zwischen 24 und 32 HPF aus dem Lichtkasten. Bewerten Sie mithilfe eines Sezierbereichs die Phänotypen und erstellen Sie eine Bewertungsrubrik. Beurteilen Sie die Embryonen, während sie der Einfachheit halber im Chorion verbleiben.

Verwenden Sie eine Pipette zur Sonde, um die Embryonen neu zu positionieren, damit sie aus verschiedenen Blickwinkeln betrachtet werden können. Für den Immunfluoreszenz-Assay werden die Embryonen nach der Inkubation in 4%igem Formaldehyd bei vier Grad Celsius über Nacht entfernt und drei- bis fünfmal mit PBST gespült. Verwerfen Sie das PBST und fügen Sie 100%iges Methanol hinzu.

Versiegeln Sie die Röhrchen und drehen Sie sie vorsichtig um, um Rest-PBST und Methanol zu mischen. Nachdem Sie die Embryonen zwei weitere Male mit Methanol gewaschen haben, lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden bis zu mehreren Jahren. Nehmen Sie mit einem Mikroskop, das für optische Schnitte ausgestattet ist, Bilder von immungefärbten Embryonen auf.

Immunfluoreszenz-Färbeexperimente mit geeigneten mRNA-Mengen und Licht-Expositions-Bedingungen zeigten, dass die pSmad-Spiegel ähnlich waren und nicht injiziert wurden, während injizierte lichtexponierte Embryonen höhere Smad-Phosphorylierungswerte aufwiesen.