Zu Beginn erhalten Sie nach der Dissoziation des ZNS-Gewebes ein Zellpellet und resuspendieren es mit 3.100 Mikrolitern DPBS in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Keine Wirbel machen. Geben Sie 1.800 Mikroliter der Lösung zur Entfernung von Ablagerungen aus dem Gehirndissoziationskit für Erwachsene zu zwei gepoolten ZNS-Zellsuspensionen.
Drehen Sie das Röhrchen um und mischen Sie die Suspension, überlagern Sie es dann vorsichtig mit 4 Millilitern kaltem DPBS und beobachten Sie einen deutlichen Gradienten. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 3.000 g bei 4 Grad Celsius mit voller Beschleunigung und ohne Pause. Nach der Zentrifugation bilden sich drei Phasen.
Saugen Sie die beiden oberen Phasen vollständig ab und entsorgen Sie sie, um sicherzustellen, dass keine Myelinreste zurückbleiben. Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem DPBS bis zu 14 Millilitern und verschließen Sie es. Drehen Sie das Röhrchen mit Kraft auf der Werkbank um, bis sich das Zellpellet vom Boden des Röhrchens löst.
Zentrifugieren Sie die Probe und saugen Sie den Überstand vollständig ab. Zur Entfernung roter Blutkörperchen geben Sie 1 Milliliter der Lösung zur Entfernung roter Blutkörperchen in das Zellpellet. Nach dem erneuten Suspendieren des Pellets wird die Lösung 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius inkubiert.
Geben Sie dann 10 Milliliter kalten PB-Puffer hinzu, zentrifugieren Sie die Probe und saugen Sie den Überstand vollständig ab. Für die Zellzählung wird die Zellsuspension um das 50-fache in PB-Puffer und dann um 1 bis 10 Verdünnung in 0,4%iger Trypanblau-Lösung verdünnt. Bestimmen Sie dann die Zellzahl mit Hilfe einer verbesserten Zählkammer.
