Extraction and Analysis of DNA from the Cellular Component of the Eye Humor

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02:08 min

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January 12th, 2024

DOI :

10.3791/200816-v

January 12th, 2024

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Noah A. Brown¹, Rajesh C. Rao¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸, Bryan L. Betz¹

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Center of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Center for RNA Biomedicine, University of Michigan, Ann Arbor, ⁷A. Alfred Taubman Medical Research Institute, University of Michigan, Ann Arbor, ⁸Section of Ophthalmology, Surgery Service, Veterans Administration Ann Arbor Healthcare System

Transkript

Um eine DNA-Extraktion durchzuführen, wird zunächst eine geeignete Menge Zelllyselösung in das aus dem Augenhumor gewonnene Zellpellet gegeben. Pipettieren Sie die Lösung auf und ab, um sie gründlich zu mischen. Sobald die Zellen vollständig lysiert sind, fügen Sie eine Proteinpräzipitatlösung hinzu, die ein Drittel des Gesamtvolumens ausmacht.

Nun 20 bis 30 Sekunden lang kräftig mischen. Dann drei Minuten bei 3000g bei Raumtemperatur schleudern. In der Zwischenzeit 300 Mikroliter Isopropanol in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, pipettieren Sie den Überstand vorsichtig in das Röhrchen mit Isopropanol. Als nächstes gibst du 1,5 Mikroliter Glykogen in das Röhrchen und drehst das Röhrchen um, um es gründlich zu mischen. Stellen Sie das Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius für eine Stunde oder über Nacht in einen Gefrierschrank, um die DNA-Ausfällung zu erleichtern.

Nach dem Einfrieren zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 3000 g bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie dann das Isopropanol heraus. Um das Pellet zu waschen, fügen Sie 0,5 Milliliter 70%iges Ethanol hinzu.

Drehen Sie den Schlauch vorsichtig um, um eine gleichmäßige Wäsche zu gewährleisten. Dann das Röhrchen eine Minute lang bei 3000g bei Raumtemperatur schleudern. Entsorgen Sie den Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen.

Drehen Sie nun das Röhrchen auf saubere Gaze, um die Lösung abzutropfen und das Pellet zu trocknen. Nach einem kurzen Schleudern in der Mikrozentrifuge wird der verbleibende Ethanoltröpfchen mit einer feinen Einwegpipettenspitze pipettiert. Als nächstes fügen Sie dem getrockneten DNA-Pellet 45 Mikroliter DNA-Hydratationslösung hinzu.

Legen Sie dann den Schlauch in einen Heizblock, der auf 50 Grad Celsius eingestellt ist. Die DNA-Ausbeute sowohl der zellulären als auch der zellfreien Bestandteile der Augenflüssigkeit war ähnlich. Es wurde eine PCR-Analyse der zellulären und zellfreien Komponenten einer vitreoretinalen Lymphom-assoziierten Mutation durchgeführt.

In der zellfreien Komponente war eine höhere Mutationsrate vorhanden, was sich in einer erniedrigten Zyklusschwelle zeigte.

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