Cell-Free DNA Extraction and Analysis from Eye Humor

Zu Beginn fügen Sie 70 Mikroliter Konditionierungspuffer für jeden Milliliter des zellfreien übernatürlichen Verstoßes gegen den Augenhumor hinzu. Vortexen Sie die Reinigungsperlen, um sie gründlich zu vermischen. Als nächstes fügen Sie die Kügelchen zur Probe hinzu und wirbeln Sie dann die Proben- und Kügelchenmischungen vor.

Diese Mischung bei 3000 g 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Ohne das Pellet zu entfernen, extrahieren Sie das Supernat und fügen Sie dann dem Pellet ein gleiches Volumen Urinpellet-Verdauungspuffer hinzu. Pipettieren Sie die Lösung auf und ab, um das Pellet wieder zu suspendieren.

Geben Sie nun Proteinase K in die resuspendierte Pelletmischung. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei 55 Grad Celsius inkubiert und dann ein gleiches Volumen genomischer Lysepuffer in die Aufschlussmischung gegeben. Die Lösung gründlich vorziehen, um sie gut zu mischen.

Setzen Sie nun die handelsübliche Schleudersäule in ein neues Sammelröhrchen. Geben Sie einen 200 Mikroliter Urin-DNA-Vorbereitungspuffer in die Spin-Säule. Bei 16.000 g eine Minute lang bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.

Pipettieren Sie nun 700 Mikroliter Urin-DNA-Waschpuffer in die Säule und zentrifugieren Sie sie, wie gezeigt. Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, überführen Sie die Spin-Säule in ein DNase-, RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen. Zum Schluss wird das entsprechende Volumen des DNA-Elutionspuffers direkt in die Säulenmatrix gegeben und drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen gelassen, dann erneut zentrifugiert, um zellfreie DNA zu erhalten.

Die DNA-Ausbeute sowohl der zellulären als auch der zellfreien Bestandteile der Augenflüssigkeit war ähnlich. Es wurde eine PCR-Analyse der zellulären und zellfreien Komponenten einer vitreoretinalen Lymphom-assoziierten Mutation durchgeführt. In der zellfreien Komponente war eine höhere Mutationsrate vorhanden, was sich in einer erniedrigten Zyklusschwelle zeigte.