Geben Sie zunächst acht Milliliter DPBS in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dazu acht Milliliter Blut hinzu und verwenden Sie eine drei Milliliter Pasteurpipette aus Kunststoff, um den Inhalt gut zu vermischen. Geben Sie 15 Milliliter Lymphozyten-Isolationsmedium in ein weiteres konisches Röhrchen.
Kippen Sie das Rohr um 20 bis 30 Grad. Tragen Sie dann mit einer Drei-Milliliter-Pasteurpipette die erste Schicht der Blut-DPBS-Mischung vorsichtig auf das Isolationsmedium auf. Tragen Sie die restliche Mischung vorsichtig über die Seitenwand des Röhrchens.
Bringen Sie den Schlauch langsam in eine aufrechte Position, um das restliche Blut auf die Blutschicht zu schichten. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einem schwingenden Eimer mit ausgeschalteten Bremsen. Die PBMC-Mischung im Blut trennt sich in vier verschiedene Schichten.
Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette zwei Drittel der Plasmaschicht und verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pipette, um die PBMCs aufzufangen. Füllen Sie die PBMCs in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen, bis die gesamte Schicht geerntet ist. Erhöhen Sie dann das Volumen mit DPBS auf 25 Milliliter, um Reste des Isolationsmediums und andere Rückstände zu entfernen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit angezogenen Bremsen. Anschließend den Überstand mit einer Vakuumpumpe entfernen. Als nächstes wird das Pellet in einem Milliliter DPBS resuspendiert und mehr DPBS hinzugefügt, um das Volumen auf 25 Milliliter zum Waschen und Resuspendieren des Pellets zu erhöhen.
Kühlen Sie einen Gefrierbehälter auf vier Grad Celsius ab. Geben Sie dann fötales Rinderserum auf Eis. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit den isolierten PBMCs in einem Milliliter fötalem Rinderserum.
Als nächstes gemischtes DMSO mit gekühltem Serum auf Eis in einem Verhältnis von eins zu fünf. Die Zellsuspension wird in zwei Milliliter markierte Kryoröhrchen überführt, wobei ein Röhrchen pro Sammelröhrchen verwendet wird. Bestimmen Sie mit einem automatisierten Zellzähler die Zellzahl und Lebensfähigkeit.
Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um einen Milliliter der DMSOFBS-Mischung in das Röhrchen zu tropfen. Legen Sie dann die Röhrchen in den vorgekühlten Gefrierbehälter. Stellen Sie den Behälter für 24 Stunden bei minus 80 Grad Celsius in den Gefrierschrank.
Am nächsten Tag nimmst du die Röhrchen aus dem Gefrierschrank und lagerst sie in der Gasphase von flüssigem Stickstoff. Die Zellzahlen und die Lebensfähigkeit waren vor und nach der Kryokonservierung konsistent, was auf eine erfolgreiche Isolierung und Konservierung hindeutet.
