Zu Beginn werden die mit dem Medikament behandelten PBMCs durch Zentrifugation geerntet und das Zelllysat in einer PCR-Platte gesammelt. Zentrifugieren Sie die Platte, um das Lysat am Boden aufzufangen. Als nächstes führen Sie die mRNA-Denaturierung mit einem Thermocycler durch.
Geben Sie dann sechs Mikroliter der Reverse-Transkriptase-Reaktionsmischung in jede Vertiefung, um ein Gesamtvolumen von 12 Mikrolitern zu erreichen. Versiegeln Sie die Platte, um sie vor Verunreinigungen zu schützen und Verdunstung zu verhindern. Zentrifugieren Sie die Platte, nachdem Sie sie kurz vortexiert haben.
Positionieren Sie die Platte auf dem Thermocycler und starten Sie das umgekehrte Transkriptionsreaktionsprogramm. Nach der reversen Transkription zentrifugieren Sie die PCR-Platte, geben 15 Mikroliter der Voramplifikationsmischung in jede Vertiefung und verschließen sie. Legen Sie die versiegelte Platte auf den Thermocycler und starten Sie die Vorverstärkungsreaktion.
Um die cDNA zu reinigen, fügen Sie jedem Well magnetische Reinigungsperlen hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Positionieren Sie die PCR-Platte fünf Minuten lang auf einem magnetischen Gestell oder bis sich die Kügelchen trennen. Danach entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
Während Sie die Platte auf dem magnetischen Gestell lassen, geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzu, um die Perlen zu reinigen. Verwenden Sie nach einer 30-sekündigen Inkubation eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. Lassen Sie die Perlen fünf Minuten lang auf dem Magnetgestell an der Luft trocknen oder bis das Ethanol vollständig verdunstet ist und die Perlen nicht mehr glänzen.
Nachdem Sie die Platte aus dem Magnetgestell genommen haben, hängen Sie die Perlen wieder in 20 Mikroliter nukleasefreiem Wasser auf. Positionieren Sie die Platte wieder auf dem Magnetgestell, bis die Perlen getrennt sind. Übertragen Sie das Eluit auf eine frische PCR-Platte, die für die cDNA-Qualitätskontrolle und Markierung vorbereitet wurde.
Für die Markierung werden drei Mikroliter der Markierungsmischung für jede Reaktion auf eine neue PCR-Platte gegeben. Zu jeder Reaktion wird ein Mikroliter cDNA hinzugefügt. Starten Sie sofort die Tagmentierungsreaktion.
Neutralisieren Sie dann die Reaktion, indem Sie jeder Reaktion einen Mikroliter neutralisierten Tagment-Puffer hinzufügen. Für die Anreicherungs-PCR werden neun Mikroliter der Anreicherungs-PCR-Mischung in jede Reaktion gegeben, um ein Gesamtvolumen von 14 Mikrolitern zu erhalten. Starten Sie das Anreicherungs-PCR-Programm.
