Legen Sie das präparierte Mausgewebe zunächst in ein kaltes Zellkulturmedium, das 5% FBS enthält. Schneiden Sie das Gewebe mit einer scharfen Sezierschere ab, bis etwa fünf Millimeter große Fragmente erhalten werden. Die gehackten Fragmente werden in ein C-Röhrchen überführt und ein Milliliter Zellkulturmedium hinzugefügt.
Laden Sie das C-Rohr auf das motorisierte Gerät und montieren Sie die Rohrhalterplatte über die D-förmigen Rohrböden. Verriegeln Sie die Spannarme in der Acrylplatte, um die Rohre an der Motorplatte zu befestigen. Um ein benutzerdefiniertes Programm auf dem motorisierten Gerät über das Hauptmenü einzustellen, drücken Sie die blaue Taste, um den benutzerdefinierten Modus auszuwählen.
Drücken Sie im ersten Menü des benutzerdefinierten Modus die grüne Taste, um die Dauer der Vorwärtsdrehung auf 30 Sekunden festzulegen. Drücken Sie dann die blaue Taste, um den Wert auf dem Bildschirm auszuwählen. Drücken Sie im zweiten Menü des benutzerdefinierten Modus die grüne Taste, um die Dauer der Rückwärtsdrehung auf 10 Sekunden festzulegen.
Drücken Sie dann die blaue Taste, um den Wert auf dem Bildschirm auszuwählen. Drücken Sie im dritten benutzerdefinierten Modusmenü die rote Taste, um die Auswahlschleifen viermal festzulegen. Drücken Sie dann die blaue Taste, um den Wert auf dem Bildschirm auszuwählen.
Stellen Sie den Spannungsregler auf 200 U/min ein und starten Sie das benutzerdefinierte Programm. Als nächstes fügen Sie das Verdauungsenzym in vier Milliliter kaltes Kulturmedium hinzu, das präpariertes Gewebe enthält. Laden Sie erneut das C-Rohr in das Gerät und wiederholen Sie das benutzerdefinierte Programm wie zuvor gezeigt.
Nach dem Lauf stellen Sie das Gerät mit den geladenen Röhrchen für 45 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Laden Sie als Nächstes das C-Rohr auf das Gerät und stellen Sie das benutzerdefinierte Programm auf 50 U/min mit Vorwärtsdrehung auf 270 Sekunden ein. Umgekehrte Drehung auf 30 Sekunden und neunmalige Schleife.
Geben Sie EDTA bis zu einer Endkonzentration von fünf Millimolar in die Probe. Stellen Sie das benutzerdefinierte Programm auf 100 U/min mit Vorwärtsdrehung auf 30 Sekunden ein. Umgekehrte Drehung auf 10 Sekunden und zweimalige Schleife.
Anschließend wird die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb geleitet und das Filtrat in einem 50- oder 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Die gesammelte Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand verworfen. Suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen und inkubieren Sie es eine Minute lang.
Neutralisieren Sie den Lysepuffer mit neun Millilitern kaltem PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und suspendieren Sie das Pellet erneut im gewünschten Puffer oder Medium. Die mit motorisiertem Gerät und manueller Dissoziation hergestellte Zellsuspension zeigte eine vergleichbare Zellviabilität und Ausbeute in Lungen-, Nieren- und Herzgeweben von Mäusen.
Immunzellpopulationen wie T-Zellen und dendritische Zellen wurden durch das Isolierungsprotokoll nicht signifikant beeinflusst. Die Oberflächenmarkerexpression zeigte auch ähnliche Häufigkeiten isolierter T-Zellen in der mittleren Fluoreszenzintensität für den Antigenpräsentationsmarker MHC II in dendritischen Zellen zwischen manueller und Geräteisolierung.
