Vor dem Zelldurchgang. Beschichten Sie eine Sechs-Well-Platte mit kalter Beschichtungslösung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, saugen Sie das Stammzellmedium aus der Sechs-Well-Platte mit menschlichen pluripotenten Stammzellen ab und geben Sie einen Milliliter Calcium-Magnesium-freies DPBS in jede Well. Nach dem zweiten Waschen 500 Mikroliter Dissoziationslösung in jede Vertiefung geben und zwei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
In der Zwischenzeit wird die Beschichtungslösung aus der Sechs-Well-Platte abgesaugt und ein Milliliter calcium-magnesiumfreies DPBS in jede Vertiefung gegeben. Beobachten Sie unter einem inversen Mikroskop den Zelldissoziationsprozess. Wenn 80 bis 90 % der Zellen abgerundet und adhärent zu sein schienen, saugen Sie die Dissoziationslösung aus den Vertiefungen der Sechs-Well-Platte ab.
Geben Sie dann einen Milliliter Stammzellmedium mit 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren in die Sechs-Well-Platte. Geben Sie 10 Mikroliter dissoziierte Zellsuspension in ein Röhrchen. Fügen Sie dann ein gleiches Volumen Trypanblau hinzu.
Mischen Sie vorsichtig und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Nach der Zellzählung zwei Milliliter Stammzellmedium pro Vertiefung mit 0,8 bis 1 mal 10 bis 6. Zellen pro Milliliter und 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren hinzufügen. Bewegen Sie die Platte dreimal schnell von einer Seite zur anderen.
Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Bewegen Sie die Platte 10 Mal schnell hin und her und von einer Seite zur anderen, bevor Sie sie zwei Stunden lang inkubieren. Tauen Sie sowohl das Basalmedium an den Tagen null und vier als auch die Nahrungsergänzungsmittel auf Eis auf.
Erwärmen Sie jeden Tag zwei Milliliter ein Medium und ein Waschmedium in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für fünf Minuten. Als nächstes saugen Sie das Stammzellmedium aus den Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte ab und fügen Sie zwei Milliliter Waschmedium hinzu. Geben Sie nach dem Ansaugen des ersten Waschmediums sofort zwei Milliliter des Mediums des ersten Tages an die Seite der Vertiefung.
Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Behandeln Sie am 12. Tag des Differenzierungsprozesses eine Sechs-Well-Platte mit 400-Mikrometer-Mikrowells mit zwei Millilitern Anti-Adhärenz-Spüllösung. Beobachten Sie die Platte unter einem inversen Mikroskop auf Blasen.
Wenn keine Blasen beobachtet werden, saugen Sie die Anti-Adhärenz-Spüllösung an und fügen Sie sofort zwei Milliliter Waschmedium zwei hinzu. Aspirieren Sie dann Pankreasvorläufermedium und fügen Sie 0,5 Milliliter Dissoziationspuffer pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen zwei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Wenn die meisten Zellen abgerundet sind und noch adhärent sind, saugen Sie den Dissoziationspuffer an und geben Sie sofort einen Milliliter warmes Clustermedium in jede Vertiefung. Dissoziieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipettenspitze vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren, während Sie abwechselnd kreisende Bewegungen ausführen und sich von oben nach unten bewegen, um die Zellen gleichmäßig im gesamten Well-Bereich zu lösen. Übertragen Sie das dissoziierte Zellgemisch in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Geben Sie einen Milliliter des Cluster-Mediums in die Sechs-Well-Platte, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Als nächstes wird das zweite Waschmedium aus der Mikrotiterplatte mit sechs Vertiefungen abgesaugt und dissoziierte Zellsuspension hinzugefügt. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag sammeln Sie mit einer P1000-Pipettenspitze langsam Cluster aus der Mikrotiterplatte mit sechs Vertiefungen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie einen Milliliter Medium für Tag 13 hinzu, um die verbleibenden Cluster zu sammeln, und geben Sie die Cluster in das Röhrchen. Lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang auf natürliche Weise unter der Schwerkraft am Boden des Röhrchens absetzen.
Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus dem Röhrchen ab, ohne die Zellverbände zu stören. Geben Sie dann zwei Milliliter Tag 13 Medium in das Röhrchen. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren und das Ansaugen von Clustern vermeiden.
Übertragen Sie die Suspension auf eine sehr niedrig haftende Sechs-Well-Platte. Bewegen Sie die Platte sechsmal schnell von einer Seite zur anderen. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Immunfluoreszenzbilder der Cluster zeigten eine Dominanz von insulinproduzierenden Zellen, die die Betazellmarker der Bauchspeicheldrüse koexprimieren. Die Expression von Betazell-Signaturgenen ergab, dass etwa 25% der Zellen Nkx6.1 und 40% Pdx1 exprimieren. Während des glukosestimulierten Insulinsekretionsassays sezernierten die MEL1-abgeleiteten Cluster signifikant höhere Insulinspiegel als Reaktion auf hohe Glukosekonzentrationen im Vergleich zu niedrigen Glukosekonzentrationen.
