Verwenden Sie zunächst die spezifischen Primer 515f und 806r, um die hypervariable V4-Region des 16S rNA-Gens zu amplifizieren. Führen Sie die PCR unter den angegebenen Bedingungen durch. Geben Sie als Nächstes 3,5 Mikroliter Sequenzierungspuffer und 1,5 Mikroliter Enzymmischung in das Röhrchen.
Nach dem Mischen und Schleudern der Probe wird eine Thermocycler-Reaktion eingeleitet. Geben Sie nun die Adapterligationsmischung in das Röhrchen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius in einem Thermocycler. Geben Sie 1,5 Mikroliter Uracil-spezifisches Extensionsreagenzenzym in die Ligationsmischung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Fügen Sie nun 43,5 Mikroliter Magnetkügelchen zur Adapterligations-DNA hinzu und mischen Sie 20 Mal. Legen Sie das Röhrchen nach fünf Minuten für fünf bis 10 Minuten zur Perlentrennung in ein Magnetgestell und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet mit 100 Mikrolitern 80% Ethanol und trocknen Sie die Kügelchen 30 Sekunden lang.
Um die Kügelchen in Pellets zu eluieren, geben Sie 8,5 Mikroliter 10 Millimolar Tris HCl in das Röhrchen und inkubieren Sie es zwei Minuten lang. Legen Sie das Röhrchen in ein Magnetgestell und entnehmen Sie 7,5 Mikroliter entgangener DNA als Überstand in ein neues Röhrchen. Geben Sie PCR-Reagenzien in das adapterligierte DNA-enthaltende Röhrchen, um eine 25-Mikroliter-Reaktion einzurichten.
Um amplifizierte DNA zu reinigen, geben Sie 22,5 Mikroliter Magnetkügelchen in das Röhrchen und mischen Sie es 20 Mal. Entfernen Sie nach fünf Minuten 50 Mikroliter Überstand und waschen Sie die Kügelchen mit 100 Mikrolitern 80%igem Ethanol. Die dunkelbraunen Kügelchen in 16 Mikroliter Wasser resuspendieren und 20 Mal mischen.
Legen Sie das Röhrchen für 30 bis 60 Sekunden in das Magnetgestell und geben Sie 15 Mikroliter in ein neues Röhrchen. Mischen Sie 90 Mikroliter Puffer, einen Mikroliter Farbstoff und zwei Mikroliter DNA-Bibliotheksprobe und lesen Sie die DNA-Konzentration auf einem Fluorimeter ab. Nachdem Sie die DNA auf zwei Nanomolare verdünnt haben, laden Sie 27 bis 30 Mikroliter der Durchflusszelle und legen Sie sie in den Sequenzierer.
Speichern Sie die vom Sequenzer erhaltenen FASTQ-Dateien. Klicken Sie hier, um eine Tabellenkalkulationsdatei zu öffnen und eine Zuordnungs- oder Metadatendatei zu erstellen. Öffnen Sie die Nephele-Website, laden Sie die FASTQ-Dateien hoch und lesen Sie QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.
Führen Sie als Nächstes mit DADA2 demultiplexierte Paired-End-Lesevorgänge, Filtersubstitution, Chimärenfehler und Zusammenführen aus. Verwenden Sie den Naive Bayes-Klassifikator, der auf der Silva Version 132 99%Operational Taxonomic Unit (OTU-Datenbank) trainiert wurde, um eine bakterielle taxonomische Zuordnung mit einer Ähnlichkeit von 97% durchzuführen. Öffnen Sie die MicrobiomeDB-Website.
Klicken Sie hier, um die Dateien hochzuladen und OTU-Alpha-Diversität, Beta-Diversität, relative Abundanz und Verdünnungskurven zu generieren. Öffnen Sie schließlich eine Tabelle und übertragen Sie Daten, um Heatmaps, Venn-Diagramme und die Effektgröße der linearen Diskriminanzanalyse zu erstellen. Eine Heatmap, die auf der relativen Häufigkeit von Bakterien in verschiedenen Stadien der Weinherstellung basiert, zeigte die Dominanz von Stämmen wie Proteobakterien, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota und Fusobacteriota.
Auf Gattungsebene wurden wichtige Gattungen wie Enterobacteriaceae und Lactobacillaceae identifiziert. Eine Venn-Diagramm-Analyse ergab 15 gemeinsame einzigartige OTUs vom Traubenmost bis zum fertigen Wein. Die Ergebnisse der Amplikon-Sequenzierung auf der Grundlage der V4-Variablenregion zeigten auch die Alpha-Diversität in den beiden Traminette-R- und L-Beta-Diversitätsanalysen, die eine Verschiebung der Bakterien während der Gärung zeigten, aber die Bakterienzusammensetzung im endgültigen Wein war ähnlich wie in den Stufen der Most- und Hefezugabe.
