Legen Sie zunächst die PDMS-Mikrotiterformen, die Anti-Adhärenz-Spüllösung und die erforderliche Laborkleidung in eine Gewebekulturhaube. Verwenden Sie zum Waschen der PDMS-Mikrotiterformen eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um 300 Mikroliter Anti-Adhärenz-Spüllösung in jede Vertiefung zu geben. Dann zentrifugieren Sie die Platte 1.620 g drei Minuten lang.
Verwenden Sie eine Vakuumpumpe und eine Pasteurpipette, um die Lösung abzusaugen. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Zellsuspension in der gewünschten Konzentration in die Mikrovertiefungen und zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 1.620 g. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator, um die Sphäroidbildung zu ermöglichen.
Um die Sphäroide zu ernten, geben Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette 500 Mikroliter vollständiges Medium fest in jede Vertiefung. Pipettieren Sie das hinzugefügte Medium in jedem Quadranten drei- bis viermal, um die Speroide zu entfernen. Anschließend wird das Medium, das die Sphäroide enthält, mit der Pipette vorsichtig in ein Mikrozentrifugenröhrchen abgesaugt.
Übertragen Sie 50 Mikroliter der Steroidsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann nacheinander 4-Arm-PEG-Acrylat und PEG-Dithiol hinzu. Mischen Sie die resultierende Lösung, indem Sie sie etwa 10 Mal auf und ab pipettieren.
Um 100 Mikroliter einer PEG-Hydrogel-Vorläuferlösung mit 10 Gew.-% zu erhalten, pipettieren Sie 20 Mikroliter der Gelvorläuferlösung zwischen zwei mit Parafilm ausgekleideten Glasobjektträgern, die mit einem Millimeter Silizium-Spacern getrennt sind, und inkubieren Sie die Objektträger mit Gel-Vorläuferlösung, um eine Gelierung zu ermöglichen. Sobald die Hydrogel-Gelierung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Gele vorsichtig mit einem Spatel von den getrennten Glasobjektträgern ab. Geben Sie ein Gel pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte, wobei Sie sicherstellen, dass die Oberfläche mit den Sphäroiden nach oben zeigt.
Geben Sie 500 Mikroliter vollständiges Medium in jede Vertiefung, um das Hydrogel vollständig einzutauchen. Legen Sie die Multiwell-Platte in einen befeuchteten Inkubator, um die Zellen zu kultivieren. Die beschriebene Technik unter Verwendung von Mikrotiterformen führte zur Bildung von Sphäroiden mit kugelförmigen Formen und streng kontrollierter Polydispersität.
Bei Sphäroiden mit 3.300 Zellen pro Mikrowell betrug die durchschnittliche Sphäroidgröße etwa 250 Mikrometer und die Zirkularität war größer als 0,8, wobei ein Wert von 1 als perfekte Kugel betrachtet wurde. Die Sphäroiddurchmesser waren abhängig von der Mikrotitergröße und der Anzahl der Zellen pro Mikrotiter.
