Saugen Sie zunächst das Medium aus den Wells an, in denen die Hydrogel-verkapselten Zellen in der 24-Well-Platte kultiviert werden. Spülen Sie die Hydrogele, indem Sie 500 Mikroliter PBS direkt in jede Vertiefung mit den Hydrogelen pipettieren und dann das PBS vorsichtig absaugen. Fügen Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette 500 Mikroliter Fixierlösung pro Vertiefung hinzu, um die Sphäroide in der 24-Well-Platte zu fixieren.
Lassen Sie das Fixiermittel die Gele 30 Minuten lang bei Raumtemperatur einweichen, bevor Sie die Fixierlösung herauspipettieren und in einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgen. Spülen Sie anschließend die Hydrogele dreimal mit PBS, wie zuvor gezeigt. Wenn Sie die Hydrogele nicht sofort verwenden, lagern Sie sie in 500 Mikrolitern PBS pro Vertiefung bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche.
Um in den Hydrogel-verkapselten Zellen zu färben, bereiten Sie zunächst entsprechend verdünnte Primärantikörper für Nestin und SOX2 vor. Nachdem Sie das PBS aus den Vertiefungen abgesaugt haben, geben Sie 50 Mikroliter der verdünnten Antikörper in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang mit den Antikörpern, um sie vollständig zu färben.
Entfernen Sie dann mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette die Färbelösung und entsorgen Sie den Abfall entsprechend. Nachdem Sie die Hydrogele dreimal gespült haben, lagern Sie sie vor der Bildgebung bis zu zwei Wochen lang bei vier Grad Celsius in PBS oder bilden Sie sie sofort ab. Um das gefärbte Sphäroid zur Verbesserung der Bildtransparenz zu entfernen, saugen Sie zuerst das PBS aus jeder Vertiefung ab.
Behandeln Sie dann die Sphäroide nacheinander mit 500 Mikrolitern 20%40% und 80% Formamid pro Vertiefung für jeweils 90 Minuten. Schließlich inkubieren Sie die Hydrogele vor der Bildgebung 24 Stunden lang in 100%igem Formamid. Die Sphäroide wurden in unterschiedlichen Z-Stapel-Tiefen abgebildet, was die Bewertung der Zellviabilität an jeder Stelle innerhalb des Z-Stapels ermöglichte.
Eine maximale Projektion unter Verwendung des Sphäroidstapels stellte den höchsten Punkt der Lichtintensität an jedem Ort dar, vereinfacht in einem Bild. Repräsentative Bilder von gefärbten Sphäroiden zeigten, dass der Transkriptionsfaktor SOX2 zur Selbsterneuerung mit DAPI im Zellkern kolokalisiert war. Im Gegenteil, Stammzellmarker Nestin war überall in den Zellen vorhanden.
Es gab keinen Unterschied zwischen dem frei schwebenden Sphäroid ohne Gel und den verkapselten Sphäroiden, möglicherweise aufgrund der Inertheit des verwendeten PEG-Gels. Die repräsentativen Bilder von optischen Schnitten bei etwa 90 Mikrometern in geklärten und ungeklärten Sphäroiden zeigten, dass der Sphäroidkern beim Clearing etwa 30 Mikrometer tiefer abgebildet werden konnte als ein ungeklärtes Sphäroid.
