1 Nachdem du scBAT2 von der euthanasierten Maus diseziert hast, 3 gib das Gewebe sofort in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 4 Stich mit einer sterilen Nadel 5 ein Loch in das obere Ende des Röhrchens und friere es in flüssigem Stickstoff ein. 6 Tränke einen Stößel und einen dünnen Spatel in flüssigem Stickstoff.
7 Gieße die schockgefrorene Gewebeprobe 8 aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in den Mörser. 9 Geben Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff in den Mörser 10 und mahlen Sie das Gewebe gründlich mit dem Stößel 11, bis es vollständig pulverisiert ist. 12 Kratzen Sie mit dem dünnen Spatel 13 das pulverisierte Gewebe ab und übertragen Sie es zurück in das Mikrozentrifugenröhrchen.
14 Sobald das gesamte Gewebe übertragen ist, 15 werden 500 Mikroliter RNA-Isolationslösung in das Röhrchen 16 gegeben und 30 Sekunden lang mit einem Pellet-Stößelmotor beschallt. 17 Verwenden Sie anschließend eine Spritze, um 10 Mal auf und ab zu pipettieren 18, um das Gewebe weiter zu verschmutzen, 19 und stellen Sie sicher, dass keine festen Partikel sichtbar sind. 20 Fügen Sie 250 Mikroliter Chloroform hinzu und wirbeln Sie gelegentlich 21 während einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur vortexen.
22 Die Proben werden 20 Minuten lang bei 21.000 g und 23 bei vier Grad Celsius zentrifugiert. 24 Die oberste wässrige Schicht wird in ein neues Röhrchen 25 überführt und eine entsprechende Menge von 70 % Ethanol hinzugefügt. 26 500 Mikroliter des Lysats 27 werden in eine Bindungssäule überführt.
28 Bei 18.000 G 60 Sekunden lang zentrifugieren 29 und das Filtrat verwerfen. 30 Für die reverse Transkription werden 0,5 bis ein Mikrogramm 31 RNA, verdünnt in DEPC-behandeltem Wasser, in einen PCR-Röhrchenstreifen gegeben. 32 Verdünnen Sie dann die CDNA auf 250 Nanogramm pro Mikroliter 33 mit DEPC-behandeltem Wasser und richten Sie die quantitative PCR ein.
34 Die Expressionsniveaus von Markergenen, die 35 an der Vermittlung der scBAT-Funktion beteiligt sind, waren relativ ähnlich 36 zwischen scBAT und interscapularer Fledermaus.
