Blasen Sie zu Beginn einen sanften Strahl Argonne in ein Glasfläschchen mit POPC-Lipiden, während Sie das Fläschchen vorsichtig drehen. Wenn die Lipide als Film am Boden des Fläschchens getrocknet sind, verschließen Sie es locker und geben Sie es dann in ein Trockenmittel. Nach einer Stunde fügen Sie 0,5 Milliliter ultrareines deionisiertes Wasser hinzu, um den Lipidfilm aufzulösen.
Wirbeln Sie die Lösung zwei Minuten lang vor. Als nächstes tränken Sie zwei Filterstützen und entionisiertes Wasser. Platzieren Sie sie auf jeder der internen Membranstützen.
Platzieren Sie dann einen 100-Nanometer-Polycarbonat-Filter zwischen den beiden internen Membranstützen, der durch das Außengehäuse des Extruders und die Haltemutter zusammengehalten wird. Platzieren Sie das Setup in den Extruderständer, um die Einrichtung des Mini-Extrusionsgeräts abzuschließen. Laden Sie als Nächstes die Lipidwassermischung in eine Ein-Milliliter-Gast-Tight-Spritze.
Verwenden Sie Schwenkarmclips, um die Spritze an einem Ende des Mini-Extruders zu befestigen. Führen Sie die zweite Spritze in das andere Ende des Mini-Extruders ein und stellen Sie sicher, dass sie vollständig eingedrückt ist. Geben Sie nun das Lipidwassergemisch aus der Originalspritze durch das Gerät in die leere.
Nachdem Sie die Extrusion 11 Mal wiederholt haben, übertragen Sie die SUVs in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um das zellfreie Expressionsprotokoll zusammenzustellen, pipettieren Sie Lösungen von eins bis 3 DNA-Plasmiden, die für lösliches SFGFP kodieren, oder Varianten von Glutamatrezeptor SFGFP, muriner RNAse und SUV-Lösung in ein Fläschchen. Fügen Sie hochreines deionisiertes Wasser hinzu, um das Reaktionsvolumen auf 20 Mikroliter zu bringen.
Übertragen Sie die zellfreie Expressionslösung auf eine konische 96-Well-V-Bodenplatte. Inkubieren Sie die Platte in einem Plattenlesegerät bei 37 Grad Celsius für vier bis fünf Stunden. Richten Sie den Plattenleser mit einer Verstärkung von 100, einer Anregung von 485 Nanometern, einer Emission von 528 Nanometern, einer Laufzeit von fünf Stunden und einer Intervallmessung von einem Messwert alle zwei Minuten ein.
Messen Sie das GFP-Signal alle zwei Minuten, um die zellfreie Reaktion in Echtzeit zu überwachen. Lösliches SFGFP hatte die höchste Expression unter allen drei Proteinen.
