Bereiten Sie zunächst die Protein-Peptid-Grenzfläche für die Sequenzdiversifizierung vor. Öffnen Sie die PDB-Datei in Chimera und stellen Sie sicher, dass die Struktur der Zieluntereinheiten intakt ist und keine Atome oder Bindungen fehlen. Um alle nicht essentiellen Moleküle aus der Struktur zu entfernen, klicken Sie auf Auswählen, dann auf Rückstand und wählen Sie dann alle Moleküle außer Standardaminosäuren aus.
Klicken Sie dann auf Aktionen gefolgt von Atomen/Bindungen und Löschen. Klicken Sie dann auf Favoriten und Sequenz und dann auf die Kette, die als Ligand betrachtet wird. Schneiden Sie die Ligandenkette auf das identifizierte interagierende Segment zu, indem Sie alle Rückstände mit Ausnahme derjenigen zwischen den ausgewählten Positionen löschen.
Klicken Sie auf Datei und PDB speichern, um die bearbeitete Struktur in einer anderen PDB-Datei zu speichern. Kopieren Sie diese Datei an einen Linux-Speicherort, auf den die Rosetta-Anwendungen zugreifen können. Verwenden Sie die feste PDB-Anwendung von Rosetta, um durch Ausführen dieses Befehls ein Repack aller Aminosäureseitenketten der Basenstruktur vor der Sequenzdiversifizierung durchzuführen.
Benennen Sie dann die neu gepackte PDB-Datei mit dem Suffix "Unterstrich repack" um, indem Sie den folgenden Befehl verwenden. Führen Sie als Nächstes pepspec im Entwurfsmodus aus, um mit diesem Befehl eine Sequenzdiversifizierung durchzuführen. Generieren Sie dann mit dem gen_pepspec_pwm ein PWM.
py-Skript in der Rosetta Suite enthalten. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um dieses Skript auszuführen. Um ein Sequenzlogo zu erstellen, öffnen Sie die Datei mit den im vorherigen Schritt generierten Peptidsequenzen mit dem bevorzugten Texteditor und kopieren Sie alle Sequenzen.
Navigieren Sie zum Weblogo-Server und fügen Sie die Sequenzen in das Textfeld für die Ausrichtung mehrerer Sequenzen ein. Wählen Sie ein gewünschtes Format und eine Größe des Logos entsprechend der Eingabelänge und klicken Sie auf Logo erstellen. Mit Hilfe dieses Protokolls wurden die Aminosäurepräferenzen für das konservierte pLxIS-Motiv in der IRF5-Bindungsoberfläche vorhergesagt.
Position, Gewichtsmatrix und Sequenzlogo, die bei der Sequenzdiversifizierung erzeugt wurden, zeigten eine Präferenz für Glutamat an Position 432 und für Leucin und Isoleucin an den Positionen 433 und 435. Die Positionen 427, 429 und 436, die typischerweise von Serin besetzt sind, zeigten eine höhere Präferenz für Aspartat und Glutamat, was die Rolle der Phosphorylierung und der IRF5-Dimerisierung unterstreicht. Position 425 zeigte eine hohe Präferenz für Serin, was darauf hindeutet, dass es in seiner unphosphorylierten Form an der Protein-Protein-Interaktion beteiligt ist.
