Schließen Sie zunächst den 3D-Drucker an einen Computer an. Laden Sie eine Ein-Milliliter-Einwegspritze mit einer Nadel in die 3D-gedruckten Klemmen. Verwenden Sie zwei M8-Innensechskantschrauben, um die Klemmen um die Spritze zu befestigen.
Drehen Sie die Leitspindel, um den Kolben manuell anzuheben, wodurch ein Luftspalt von zwei Millilitern in der Spritze entsteht. Um Kulturen von Vibrio cholerae herzustellen, inokulieren Sie die Zellen in drei Milliliter Luria-Bouillon mit 10 sterilen Glasperlen. Züchten Sie die Zellen in einem Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius für fünf bis sechs Stunden.
Impfen Sie E.Coli in ähnlicher Weise in drei Milliliter flüssige Luria-Brühe. Nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius werden 200 Mikroliter der Kultur drei Stunden lang in frischer Luria-Brühe geimpft. Übertragen Sie die Kultur in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Dann zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 644 g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nun den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Mikrolitern flüssiger Luria-Brühe. Laden Sie als Nächstes eine leere Drei-Milliliter-Kunststoff-Köderverschlussspritze in den 3D-Biodrucker.
Verbinden Sie den Spritzenkolben mit der Leitspindel. Ziehen Sie die Spritze manuell zurück, um den Luftspalt zu übertragen und eine bessere Bewegung des Kolbens zu ermöglichen. Befestigen Sie eine stumpfe Nadel geeigneter Größe an der Spritzenspitze.
Drehen Sie die Schraube manuell, um den Spritzenkolben zurückzuziehen und die Bakteriensuspension in die Spritze zu laden. Um die körnige Hydrogelmischung herzustellen, mischen Sie trockenes Granulat aus vernetzter Acrylsäure mit 400 Millilitern 2%iger Lennox Luria-Bertani-Brühe. Stellen Sie den pH-Wert mit 500-Mikroliter-Schritten von 10 molarem Natriumhydroxid auf 7,4 ein und testen Sie den pH-Wert auf einem Teststreifen.
Verwenden Sie eine sterile 50-Milliliter-Kunststoffspritze, um die Hydrogelmischung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Die Matrix wird eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 161 g zentrifugiert. Verwenden Sie anschließend eine 30-Milliliter-Spritze, um das erforderliche Volumen der Matrix in einen Behälter zu übertragen, in dem gedruckt wird.
Legen Sie dann die Probenbehälter mit der Hydrogelmatrix in die Halterungen auf der Bauplattform des Druckers. Starten Sie die 3D-Drucksoftware. Klicken Sie auf Datei und dann auf Datei öffnen, um einen vorprogrammierten Gcode in die Software zu laden.
Geben Sie die Verschiebelänge ein. Verschieben Sie dann die X-, Y- und Z-Ebenen, um die Druckköpfe auf der X/Y-Ebene zu zentrieren. Drücken Sie auf das Home-Symbol, um die Z-Achse neu einzustellen.
Drehen Sie die Schraube manuell langsam, um den Spritzenkolben zu drücken, bis eine kleine Menge der Bakteriensuspension an der Nadelspitze zu sehen ist. Wischen Sie die überschüssige Suspension mit einem sterilen Einwegtuch ab. Senken Sie nun den Druckkopf in einem festen Abstand in das Hydrogelmedium eines beliebigen Probenbehälters ab.
Klicken Sie auf Drucken, um den Druckvorgang zu starten. Sobald der Druck abgeschlossen ist, schließen Sie die Probenbehälter. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel ordnungsgemäß.
Wischen Sie den Drucker mit 70 % Ethanol ab. Verwenden Sie für die Bildgebung mit großem Sichtfeld eine Kamera mit einem angebrachten Zoomobjektiv. Bilden Sie die Zellen direkt nach dem Drucken bei Raumtemperatur ab.
Anschließend werden die Proben in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius überführt. Unterschiede in der Porengröße der Matrix schienen die nicht-modale zelluläre Ausbreitung nicht zu beeinflussen. Modalzellen breiten sich jedoch schneller in der Matrix mit größeren Poren im Vergleich zu den kleineren Poren aus.
Die Kolonie von Vibrio cholerae in Hydrogelmatrizen mit größeren Poren breitete sich mit glatten diffusen Wolken aus. Die diffusen Wolken fehlten in nicht-modalen Zellen. Die Kolonie in Hydrogelmatrizen mit kleineren Poren breitet sich nur durch raue, fraktalartige Wolken sowohl für modale als auch für nicht-modale Zellen aus.
Es wurde beobachtet, dass sich beide Zellen in den ersten 150 Stunden mit ähnlichen Geschwindigkeiten ausbreiteten. Über längere Zeiträume zeigten einige Proben jedoch schnellere Ausbreitungsraten. Nach dem Experiment wurde im Hydrogel eine verringerte Streckspannung, Speichermodule und Verlustmodule beobachtet.
