Schalten Sie zunächst den Laminar-Airflow-Schrank ein, so dass er sich drei Minuten lang stabilisieren kann. Reinigen und desinfizieren Sie die Innenflächen des Schranks aseptisch mit den folgenden Desinfektionsmitteln. Legen Sie nach der Desinfektion von Material, das in den Schrank gelangt, Servietten und Nitrilhandschuhe in den Schrank.
Schalten Sie dann den Schrank aus und setzen Sie ihn 15 Minuten lang ultraviolettem Licht aus. Starten Sie nach der Bestrahlung den Schrank neu. Geben Sie die Reagenzien für das Primer-Design in einen mit Eis gefüllten Kühler.
Nachdem Sie ihn mit 70% Ethanol desinfiziert haben, stellen Sie den Behälter in den Schrank. Bereiten Sie die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation oder den LAMP-Mix in einem 0,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Pipettieren Sie die Mischung, um sie zu homogenisieren.
Inkubieren Sie anschließend die geschlossenen Röhrchen in einem Heizblock bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Kühlen Sie dann die Röhrchen in einem mit Eis gefüllten Styroporkühler fünf Minuten lang ab. Legen Sie die Rohre nach dem Abkühlen in den Laminar-Flow-Schrank.
Um den LAMP-Mix zu vervollständigen, fügen Sie vier Mikroliter DNA-Polymerase hinzu, gefolgt von einem Mikroliter reverser Transkriptase. Um eine kolorimetrische Detektion durchzuführen, fügen Sie Dihydroxynaphtholblau hinzu. Nach der Zugabe der Reagenzien pipettieren Sie jede Lösung, um die LAMP-Reagenzien richtig zu mischen.
Pipettieren Sie anschließend 22 Mikroliter der Lösung in PCR-Röhrchen und achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden. Für die Negativkontrolle fügen Sie drei Mikroliter 0,1%ige Diethylpyrocarbonat-Wasser hinzu. Bewahren Sie alle verbleibenden Röhrchen für die Zugabe von genetischem Material beiseite.
Entfernen Sie anschließend alle Materialien aus dem Schrank. Nachdem Sie die Schrankoberflächen mit 70 % Ethanol desinfiziert haben, schalten Sie ihn aus. Geben Sie in einem separaten Bereich drei Mikroliter der Probe in jedes PCR-Röhrchen und pipettieren Sie sie gut mit einer 20-Mikroliter-Mikropipette, um sie gründlich zu homogenisieren.
Bevor Sie die kolorimetrische Reaktion starten, verwenden Sie eine hochwertige Kamera, um Bilder von den PCR-Röhrchen aufzunehmen. Führen Sie nun die Reaktion mit einem Thermocycler und einem Wasserbad durch. Legen Sie für den Thermocycler die Rohre in den Reaktionsblock und richten Sie das Thermoprofil auf dem Gerät ein.
Wenn Sie das Wasserbad verwenden, legen Sie die Schläuche sicher in kreisförmige Behälter und stellen Sie diese Behälter dann für 60 Minuten in das Wasserbad bei 66,3 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Einwirkzeit die Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Wenn eine kolorimetrische Reaktion durchgeführt wurde, nehmen Sie Bilder der PCR mit einer hochwertigen Kamera auf.
Ein Temperaturgradient zeigte, dass die optimale Schmelztemperatur bei 66,3 Grad Celsius lag. Die Konzentration des Enzyms BST 3.0 wurde auf 3,2 internationale Einheiten pro Mikroliter optimiert. Um die kolorimetrische Strategie zu definieren, wurde Phenolrot in neutralroten Farbstoffen bewertet.
Nach der Amplifikation wurde jedoch keine Farbveränderung beobachtet. Die Standardisierung verschiedener Konzentrationen von Hydroxynaphtholblau wurde durchgeführt, wobei die optimale Änderung mit 125 Mikromol Hydroxynaphtholblau erfolgte. Die amplifizierten Proben zeigten eine Veränderung der Farbe in Abhängigkeit von ihrer Konzentration.
Die Probenamplifikation wurde durch Elektrophorese weiter bestätigt.
