Zentrifugieren Sie zunächst trypsinisierte normale humane dermale Fibroblasten. Entfernen Sie den Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen. Geben Sie vorgewärmtes ergänztes DMEM-Medium mit niedrigem Glukosegehalt in das Pellet und mischen Sie es gut, um es wieder zu suspendieren.
Die normalen humanen dermalen Fibroblasten werden in eine 10 Zentimeter große adhärente Zellkulturschale gegeben. Schütteln Sie die Form vorsichtig quer. Nach 14 Tagen 2D-Stimulation, wenn die Zellen konfluent geworden sind, aspirieren Sie das Medium und verwenden Sie einen Zellschaber, um das gebildete Zellblatt vorsichtig und schnell von der Schale zu lösen.
Rollen Sie gleichzeitig das Zellblatt zu einem 3D-stäbchenartigen Organoid. Übertragen Sie die normalen humanen dermalen Fibroblasten-Organoide in eine 10 Zentimeter breite, nicht adhärente Petrischale. Messen Sie die Dehnung mit einem Lineal.
Halten Sie dann eine Seite des Organoids mit einer Pinzette fest und dehnen Sie das Organoid vorsichtig, bis es axial um ca. 10 % verlängert wurde. Drücken Sie mit einer Pinzette die Metallstifte manuell durch beide Kanten des Organoids in die Kunststoffschale, um es zu fixieren. Zum Schluss für die 3D-Reifung vor der Inkubation 10 Milliliter vorgewärmtes, ergänztes DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt hinzufügen. Die grobe Morphologie der 3D-Organoide an den Tagen null und 14 des 3D-Reifungsschritts zeigte ein glitzerndes, weißes Aussehen.
Mit der Zeit zogen sich die Organoide zusammen und erschienen dichter. Die Morphologie der Organoide wurde mittels H-E-Färbung untersucht. Am ersten Tag zeigten die Organoide unzusammenhängende Schichten, die hauptsächlich aus Zellen bestanden, die von geringen Mengen an Matrix umgeben waren.
Die Zellen innerhalb der Schichten wiesen Kerne mit runder Form und unterschiedlicher Größe auf. Am 14. Tag wurde ein merklicher Anstieg des Eosin-Signals beobachtet, was auf Matrixablagerung und verschmolzene Schichten hindeutete. Darüber hinaus zeigten die Organoide das Vorhandensein von Bereichen, die ausgerichtete Zellen enthielten.
Die Mehrzahl der Kerne hatte ähnliche Größen und war gelegentlich länglich.
