Führen Sie zunächst eine Zeitrafferbildgebung von lebenden T-Lymphozyten durch, die aus sekundärem lymphatischem Gewebe der Maus isoliert wurden. Öffnen Sie für die Analyse der T-Zell-Migration die Velocity-Software, und erstellen Sie eine neue Bildsequenz. Wählen Sie Videos mit Zeitraffer-Videomikroskopie aus und verschieben Sie sie in den blauen Bereich in Velocity.
Ändern Sie mit dem Kontrastverbesserungswerkzeug die Helligkeit und den Kontrast und passen Sie dann die Bildgrößen auf 0,325 Mikrometer für 20x und 0,65 Mikrometer für 10x Vergrößerung an. Nachdem Sie die Sequenz zum Festlegen von Zeitpunkten konfiguriert haben, gehen Sie zur Registerkarte Messung und deaktivieren Sie alle Zeitpunkte. Suchen Sie als Nächstes Objekte anhand der Intensität und schieben Sie den Balken nach rechts vom Peak.
Um Zelltrümmer zu vermeiden, schließen Sie alle Zellen mit einem Durchmesser von weniger als 10 Mikrometern und mehr als 100 Mikrometern aus. Aktivieren Sie "Statische Objekte ignorieren" und anschließend "Defekte Gleise automatisch verbinden". Um ein neues Protokoll zu speichern, gehen Sie zu Messungen.
Klicken Sie auf Protokoll speichern, gefolgt von Name neues Protokoll. Klicken Sie im Tab "Messung" auf "Alle Zeitpunkte messen" und sortieren Sie die Tracks nach Zeitspanne von hoch nach niedrig. Nachdem Sie die Spur-ID-Nummern für die Zellen mit guten Spuren aufgezeichnet haben, exportieren Sie die Datei als kommagetrennten Text und übertragen Sie die Daten an die gewünschte Analysesoftware.
Um manuelles Tracking durchzuführen, öffnen Sie Bild J, gehen Sie zu Plugins und wählen Sie Tracking und manuelles Tracking aus. Legen Sie die Zeitintervalle für die X-x-Y-Kalibrierung, die Pixelgröße und die Z-Kalibrierung fest. Klicken Sie anschließend auf Track hinzufügen, um die individuelle Zellverfolgung zu starten.
Markieren Sie eine Zelle zum ersten Zeitpunkt, und setzen Sie sie über alle Zeitpunkte fort. Klicken Sie abschließend auf Endspur. Softwaregestütztes Zelltracking, charakterisiert das Migrationsverhalten aktivierter einzelner T-Zellen, wie es durch die unterschiedlich gefärbten Linien gekennzeichnet ist.
