Wir danken früheren und aktuellen Mitgliedern des Kim-Labors, die im Laufe der Zeit zur Entwicklung dieser Protokolle beigetragen haben. Repräsentative Daten wurden durch P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Vereinigte Staaten und P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Vereinigte Staaten ermöglicht. Diese Veröffentlichung wurde zum Teil durch die Fördernummer T32 ermöglicht, die GM135134 des Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award vergeben wurde.

Die Tierprotokolle wurden vom University Committee on Animal Resources an der University of Rochester genehmigt. Die Mäuse in dieser Studie wurden im pathogenfreien Raum der Tiereinrichtung der University of Rochester gehalten. Für die vorliegende Studie wurden männliche/weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen (15-30 g) verwendet. Die Isolierung des Gewebes von Mäusen kann auf einem Labortisch mit Handschuhen zum Bedecken der Hände und einer Gesichtsmaske zum Bedecken von Nase und Mund oder in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Alle Zellkultur- und Plattenvorbereitungen müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. CD8+ T-Zellreinigung und -aktivierung
<ol><li>Vorbereitung der Materialien<ol><li>Für die negative Selektion von CD8+ T-Zellen: Bereiten Sie ein negatives Selektionsmedium aus dem Überstand der Hybridom-Zelllinien GK1.5 und M5/114 Antikörper her, die Anti-CD4 bzw. Anti-MHCII produzieren. Mischen Sie den Überstand im Verhältnis 1:1, filtrieren Sie ihn und lagern Sie ihn bei 4 °C für die zukünftige Verwendung (>0,5 μg jedes Antikörpers/eine Million Zellen insgesamt). Alternativ sind kommerzielle CD8+ T-Zell-Isolationskits erhältlich.</li>
		<li>Zur Aktivierung von T-Zellen: 500 μl CD3 (10 μg/ml) und CD28 (16 μg/ml) Antikörper in 1x DPBS (ohne Calcium und Magnesium) in eine mit Nicht-Gewebekultur (TC) behandelte 24-Well-Platte geben und über Nacht bei 4 °C lagern, um die Plattenbindung zu gewährleisten. HINWEIS: Antikörper und Proteine beschichten nicht TC-behandelte Kulturplatten/-schalen besser als normale TC-behandelte, daher werden nicht TC-behandelte Kulturplatten für die T-Zell-Generierung verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie eine 10-cm-Kulturschale (oder ein gleichwertiges Gefäß) vor, indem Sie ein 70-μm-Zellsieb in die Schale geben und 2 mL R9-Medium in den Filter abgeben (R9-Medium: RPMI 1640x, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum-Antimykotikum, 20 mM HEPES-Puffer, 1 % MEM-nicht-essentielle Aminosäuren, 50 μM β-Mercaptoethanol).</li>
	<li>Erhalten Sie eine Maus mit entsprechendem genetischen Hintergrund, Geschlecht, Alter und Gewicht, wie durch das Versuchsdesign bestimmt.</li>
	<li>Euthanasieren Sie die Maus mit CO2 , gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation oder geeigneten Euthanasiestrategien, wie sie in den örtlichen Tierpflege- und -verwendungsprotokollen definiert und von der Einrichtung genehmigt sind.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus in Rückenlage, strecken Sie alle vier Gliedmaßen senkrecht zum Körper und befestigen Sie die Fußpolster mit Maus-Dissektions-T-Stiften oder Ähnlichem an einem Sezierbrett. Machen Sie mit einer chirurgischen Präparierschere der Maus einen oberflächlichen, zentralen Schnitt durch die Hautschicht am ventralen Unterbauch und schneiden Sie gerade bis zum Kinn (~8 cm). Trennen Sie die Haut von der Bauchfellschleimhaut, um die Lymphknoten freizulegen. Dehnen Sie die Haut senkrecht vom Rumpf weg und stecken Sie sie fest5.<ol><li>Schneiden Sie die zervikalen, axialen, brachialen und leistenförmigen Lymphknoten vorsichtig bilateral mit einer stumpfen Pinzette (oder dem bevorzugten Typ aus einem chirurgischen Präparierset für die Maus) heraus. In das in Schritt 1.2 vorbereitete Zellsieb umfüllen.</li>
		<li>Öffnen Sie das Bauchfell und entfernen Sie die Milz. In das in Schritt 1.2 vorbereitete Zellsieb umfüllen.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Mauskadaver in dem entsprechenden Behälter für biologische Gefahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie eine einzellige Suspension des sekundären lymphatischen Gewebes durch mechanischen Aufschluss über dem 70 μm Zellsieb mit 2 mL R9-Medium aus Schritt 1.2 vor, indem Sie das Gewebeaufschlusswerkzeug wiederholt um eine halbe Umdrehung im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn drehen. HINWEIS: Das Kolbenende einer Luer-Lock-Spritze, entweder 3 mL oder 10 mL, eignet sich gut, um das Gewebe zu zerkleinern und zu homogenisieren. Alternative Materialien können nach Ermessen des Benutzers verwendet werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen, das Spritzenende, das Sieb und die Kulturschale mit 7 ml Medium und stellen Sie sicher, dass das Sieb aufrecht bleibt, um die Übertragung größerer Gewebestücke oder zellulärer Aggregate, die möglicherweise vorhanden sein könnten, in die Einzelzellsuspension zu verhindern.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Die Zellen bei 270 x g bei Raumtemperatur (20 °C) 5 min pelletieren und den Überstand dekantieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 Minute lang 500 μl Lysierungspuffer hinzu, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Mit 9,5 mL R9 Medium verdünnen und bei 270 x g (20 °C) 5 min schleudern. Dekantieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Das Pellet wird in 10 ml des zuvor vorbereiteten negativen Selektionsmediums, das Anti-MHCII und Anti-CD4 enthält, resuspendiert (Schritt 1.1.1). Bei Raumtemperatur (20 °C) 30 min schaukeln.</li>
	<li>Die Zellen bei 270 x g 5 min pelletieren und den Überstand dekantieren. 3x mit 10 mL R9 Medium waschen.</li>
	<li>Waschen Sie gleichzeitig in einem konischen 15-ml-Röhrchen 200 μl Anti-Ratten-IgG-Kügelchen für Schafe in 7 mL Medium. Setzen Sie die Tube auf einen Magneten, entfernen Sie das Medium und wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 7 mL R9 Medium.</li>
	<li>Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 270 x g (20 °C) pelletiert, der Überstand dekantiert und das Pellet dann in 7 mL Bead-Suspension aus Schritt 1.13 resuspendiert. Bei Raumtemperatur (20 °C) 45 min schaukeln.</li>
	<li>Anreicherung von CD8+ T-Zellen durch Depletion magnetischer Beads. Legen Sie das konische Röhrchen 3 Minuten lang direkt auf den Magneten ohne Deckel, um Antikörper-/Kügelchen-gebundene Zellen zu entfernen. CD8+ -Zellen sollten erhalten bleiben. Während sich das Röhrchen noch im Magneten befindet, entnehmen Sie die Zellsuspension mit einer serologischen Pipette oder einem gleichwertigen Gerät und geben Sie sie in ein neues 15-ml-Röhrchen. Bei 270 x g (20 °C) 5 min zentrifugieren und 3x bei mittlerer Hitze waschen.</li>
	<li>Waschen Sie die vorbeschichtete Aktivierungsplatte (Schritt 1.1.2) zweimal mit 1x DPBS, ohne direkt auf die Unterseite der Platte zu pipettieren.</li>
	<li>Optional: Führen Sie eine Trennung von lebenden/toten Lymphozyten durch, um abgestorbene Zellen zu entfernen.<ol><li>Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Geben Sie vorsichtig 2 ml Lymphozytentrennmedium auf den Boden der Zellsuspension. Zentrifugieren bei 900 x g für 10 min (bei Raumtemperatur) bei geringer Beschleunigung und Verzögerung. HINWEIS: Lebende Zellen trennen sich an der Grenzfläche von Medium und Trennmedium (mittlere weiße Schicht). Abgestorbene Zellen pelletieren am Boden des Röhrchens und können am Ende entsorgt werden.</li>
		<li>Die mittlere Schicht mit lebenden Lymphozyten in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 270 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 12 mL Medium mit 10 U/mL rekombinantem Maus-IL-2. 1 ml pro Vertiefung in eine nicht TC-behandelte 24-Well-Platte einfüllen und über Nacht auf 37 °C erhitzen.</li>
</ol>2. Anheben der aktivierten CD8+ T-Zellen
<ol><li>Visualisieren Sie Zellen mit einem Standard-Tischlichtmikroskop mit dem 4x- oder 10x-Objektiv. HINWEIS: Aktivierte T-Zellen erscheinen im Vergleich zu inaktivierten T-Zellen größer und rund oder länglich und sollten im gesamten Well dichte Zellcluster aufweisen.</li>
	<li>Um die aktivierten Zellen anzuheben, brechen Sie die Zellen mit einer 1-ml-Pipette auf und achten Sie darauf, dass sie an den Rändern der Platte gut vermischt sind. Übertragen Sie die Zellen in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen. HINWEIS: Aktivierte Zellen sind klebriger und erfordern ein kräftigeres Pipettieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Vertiefungen mit 1 ml R9-Medium, um alle verbleibenden Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie dies bei Bedarf noch einmal. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 270 x g (20 °C) für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Führen Sie eine Trennung von lebenden/toten Lymphozyten durch, um abgestorbene Zellen zu entfernen, wie in den Schritten 1.17-1.18.</li>
	<li>Pflegen Sie die T-Zellen durch Entnahme lebender/toter Zellen alle 3-4 Tage in R9-Medium mit IL-2 in einer 6-Well-Platte ohne TC. HINWEIS: T-Zellen vermehren sich während der frühen Aktivierung besser in Vertiefungen mit kleinen Abmessungen, möglicherweise aufgrund von T-Zell-T-Zell-Kontakten oder von T-Zellen abgeleiteten löslichen Faktoren, die ihre Aktivierung unterstützen. Eine schnelle T-Zell-Proliferation führt dazu, dass das Kulturmedium innerhalb von 24-48 Stunden nach der Kultur gelb wird. Heben Sie zu diesem Zeitpunkt die Zellen an und überführen Sie sie in eine größere Vertiefung (unbeschichtete, nicht TC 6-Well-Platte) mit ausreichend frischem Kulturmedium, um die Zellen zu füttern (typischerweise 5 ml pro Vertiefung). Ersetzen Sie erschöpftes Medium durch frisches, wenn dies durch eine Farbänderung des gelben Mediums angezeigt wird, oder alle 3-4 Tage.</li>
</ol>3. Zubereitung der Glasschale
<ol><li>Bereiten Sie die Migrationskammern oder -platten der Glaszellen vor, indem Sie über Nacht bei 4 °C mit 300 μl/cm 2 Protein A (0,1 mg/ml) beschichten, zweimal mit 1x DPBS waschen, indem Sie auf die Schale geben und dekantieren, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.</li>
	<li>Beschichten Sie die Migrationskammer oder -platte mit 300 μl/cm 2 rekombinanten Maus-ICAM-1- oder VCAM-1-Fc-Chimären (0,1-2,75 mg/ml) zusammen mit einem rekombinanten Maus-Chemokin (0,1-10 μg/ml) für 2-3 h bei Raumtemperatur. Andere Integrin-Liganden wie Fibronektin, Maus-Kollagen IV und Maus-E-Cadherin werden so gerendert, dass sie die Kammer bei 2,5-10 μg/ml über Nacht bei 4 °C direkt beschichten.<ol><li>Spülen Sie die Kammern zweimal mit 1x DPBS, indem Sie auf die Schale geben und unmittelbar danach dekantieren, bevor Sie Zellen hinzufügen. HINWEIS: T-Zellen können in unterschiedlichen Konzentrationen von Integrin-Liganden und Chemokinen je nach Status der Aktivierung, Differenzierung, Sensibilisierung und des Primings unterschiedlich migrieren. Es wird dringend empfohlen, die Zellmigration in mehreren verschiedenen Konzentrationen zu untersuchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Plattieren Sie die adhärenten Zellen 24 Stunden vor Beginn der Bildgebung auf glasbeschichteten Platten, wenn T-Zellen mit anderen Zellen, wie z. B. Krebszellen, kokultiviert werden, um die T-Zell-Abtötung von Krebszellen in Echtzeit zu messen.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Optional: T-Zellen und adhärente Zellen mit einem Zelltracker-Farbstoff nach Wahl bei 1 μg/mL pro 1 x 107 Zellen in 1x DPBS für 15 min bei 37 °C oder nach Herstellerprotokoll färben.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem gleichwertigen Messgerät.</li>
	<li>Platte: 1 x 105 CD8+ T-Zellen (oder gewünschte Menge) in Leibovitz' L-15-Medium, ergänzt mit 1-5 g/L Glukose in einer 37 °C Kammer. HINWEIS: L-15-Medium ist für die Verwendung ohne CO 2-Natriumbicarbonat-System formuliert. Es wird mit freien basischen Aminosäuren, Phosphatpuffern und Galaktose gepuffert, um den pH-Wert aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Optional: Führen Sie eine Integrin-Blockierung durch.<ol><li>T-Zellen mit einem blockierenden Antikörper gegen ein Integrin (1-10 μg/ml, Anti-Maus-CD11a (M17/4), Anti-Maus-CD18 (M18/2), Anti-Maus-VLA-4 (9C10) für 10 min vorinkubieren und in Gegenwart desselben Antikörpers kriechen lassen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Zeitraffer-Mikroskopie
<ol><li>Führen Sie eine Videomikroskopie durch.</li>
	<li>Bei T-Zellen können Sie alle 10-60 s Hellfeld- und Fluoreszenzbilder für 10-60 Minuten oder die gewünschten Aufnahmeeinstellungen aufnehmen. HINWEIS: Die T-Zell-Migration ist temperaturempfindlich, und die optimale Temperatur für die T-Zell-Migration der Maus beträgt 37 °C. Das Temperiersystem, das in diesem Protokoll verwendet wird, besteht aus einem geschlossenen und isolierten Mikroskopdeck mit angeschlossenem Heizsystem. Die Bildgebungskammer befindet sich auf dem Bildgebungsdeck. Der Umfang dieser Kammer besteht aus einem mit destilliertem Wasser gefüllten Brunnen, der eine gleichmäßige Hitze und Luftfeuchtigkeit während der Bildgebung ermöglicht. Die Mikrovertiefung befindet sich in der Mitte der Bildgebungskammer.</li>
</ol>6. Softwaregestützte Analyse der T-Zell-Migration
<ol><li>Verwenden Sie die Volocity-Software, um die T-Zell-Migration zu bewerten.<ol><li>Öffnen Sie Volocity und erstellen Sie eine neue Bildsequenz.</li>
		<li>Wählen Sie alle Zeitraffer-Videomikroskopiefilme aus und verschieben Sie sie in den blauen Bereich in Volocity.</li>
		<li>Passen Sie Helligkeit und Kontrast mit dem Kontrastverbesserungswerkzeug an die gewünschten Einstellungen des Forschers an.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Bildgrößen: 0,325 μm für 20x, 0,65 μm für 10x.</li>
		<li>Reihenfolge: Setzen Sie Zeitpunkte (z. B. 81 Bilder, wenn alle 15 s für 20 Minuten ein Bild aufgenommen wird, 4 pro Minute).</li>
		<li>Deaktivieren Sie alle Zeitpunkte auf der Registerkarte "Messung".</li>
		<li>Suchen Sie Objekte mit der Intensität – schieben Sie die Leiste so, dass sie sich genau rechts vom Peak befindet.</li>
		<li>Objekte nach Größe ausschließen: alle Zellen mit einem Durchmesser von weniger als 10 μm und mehr als 100 μm, um Zellreste oder nicht-zelluläre Partikel auszuschließen. Schließen Sie T-Zellen aus, die weniger als 20 % der Aufzeichnungszeit wandern (was je nach Definition des jeweiligen Prüfarztes variieren kann).</li>
		<li>Statische Objekte ignorieren (Kontrollkästchen).</li>
		<li>Unterbrochene Bezirke automatisch verbinden (Kontrollkästchen).</li>
		<li>Stellen Sie den kürzesten Pfad auf nicht mehr als 20 μm ein.</li>
		<li>Die Spur einer Zellmigration ist die Linie, die die Position derselben Zelle im Laufe der Zeit verbindet. Stellen Sie sicher, dass der Tracking-Algorithmus die Verfolgung durchführt, indem Sie durch Segmentierung in jedem Frame erkennen, wo einzelne Objekte erkannt werden, und die Objekte über Frames hinweg abgleichen.</li>
		<li>Speichern Sie ein neues Protokoll, indem Sie Messungen > Protokoll speichern > Namen Neues Protokoll auswählen.</li>
		<li>Klicken Sie auf der Registerkarte "Messung" auf "Alle Zeitpunkte messen".</li>
		<li>Sortieren Sie Tracks nach Zeitspanne, von hoch nach niedrig.</li>
		<li>Notieren Sie die Spur-ID-Nummern für alle Zellen mit guten Spuren, wie vom Untersucher definiert. Nach der automatischen Zellverfolgung ist eine manuelle Auswertung jeder Zellspur notwendig, um falsch identifizierte oder defekte Spuren auszuschließen. Schließen Sie Zellen mit fehlerhaften Spuren aus.</li>
		<li>Exportieren Sie die Datei als kommagetrennten Text und übertragen Sie die Daten an die gewünschte Analysesoftware. HINWEIS: Grundlegende Parameter: Geschwindigkeit (μm/min), Verschiebung (Nettobewegung, μm), Gleislänge (Gesamtweglänge, μm) und Mäanderindex (MI; Nettoverschiebung/Gleislänge). MI = 1 steht für eine vollständig gerade lineare Bahn).</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine manuelle Nachverfolgung mit Image J durch.<ol><li>Öffnen Sie Plugins und wählen Sie Tracking und manuelles Tracking aus. Stellen Sie die Parameter ein - Zeitintervalle, x/y-Kalibrierung (Pixelgröße) und z-Kalibrierung (im manuellen Tracking-Modus). Starten Sie die Verfolgung einzelner Zellen, indem Sie auf Spur hinzufügen klicken, eine Zelle zum ersten Zeitpunkt auswählen und über alle Zeitpunkte hinweg fortsetzen. Klicken Sie anschließend auf Track beenden. Wiederholen Sie dies für alle interessierenden Zellen. HINWEIS: Trackmate, ein weiteres Tool für die Zellverfolgung, ist eine automatische Tracking-Software, die über das ImageJ-Plugin verfügbar ist.</li>
	</ol></li>
</ol>

Aufklärung der T-Zell-Kinetik: Methoden zur Echtzeit-Migrationsanalyse

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhausted+mature+dendritic+cells+exhibit+a+slower+and+less+persistent+random+motility+but+retain+chemotaxis+against+ccl19.">Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19.</a> Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).</li><li>Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+crawling+in+capillaries:+A+novel+immune+response+to+staphylococcus+aureus.">Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+within+a+three-dimensional+collagen+matrix.">Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix.</a> J Vis Exp. (92), e51963 (2014).</li><li>Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+migration+does+not+follow+a+random+walk.">Three-dimensional cell migration does not follow a random walk.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Overstreet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+interstitial+migration+of+effector+CD4(+)+T+cells+is+dependent+on+integrin+&#945;v.">Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin &#945;v.</a> Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass alle Recherchen und die Erstellung des Manuskripts in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurden, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Das Verständnis der biologischen Auswirkungen konvergierender Signale in vivo ist eine Herausforderung und nicht einfach zu interpretieren. Die hierin vorgestellten Protokolle stellen eine vernünftige Methode dar, um die T-Zell-Migration unter hochdefinierten und biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen. Diese Bedingungen können nach Ermessen des Prüfarztes festgelegt werden, und die Protokolle können an die Bedürfnisse verschiedener T-Zellpopulationen, des Aktivierungsstatus und des Zellphänotyps a...

T-Zellen sind die Haupteffektoren der adaptiven, antigenspezifischen Immunantwort. Auf Populationsebene sind T-Zellen heterogen und bestehen aus zellulären Untergruppen mit unterschiedlichen spezialisierten Funktionen. Wichtig ist, dass CD8+ T-Zellen die wichtigsten zytolytischen Effektoren des Immunsystems sind, die infizierte oder dysfunktionale Zellen direkt eliminieren1.
Reife CD8+ T-Zellen befinden sich im Gewebe und zirkulieren auf der Suche nach Antigenen durch Blut und Lymphgefäße. Während der Infektion werden T-Zellen mit Antigenen im Blut oder Gewebe präsentiert und fließen schnell in die Milz oder den nächstgelegenen drainierenden Lymphknoten ab, um eine produktive Immunantwort zu starten. In beiden Fällen werden T-Zellen aktiviert, durchlaufen eine klonale Expansion und verlassen das Lymphsystem, um ins Blut zu gelangen, falls dies nicht bereits der Fall ist. Während dieses Prozesses bewirkt die intrazelluläre Signalübertragung die Herunterregulierung der lymphatischen Homing-Rezeptoren und die Hochregulierung zahlreicher Integrin- und Chemokinrezeptoren, die für die gewebespezifische Migration unerlässlich sind2. Letztendlich wird die gerichtete Migration von T-Zellen zu den Infektionsherden durch konvergierende Umweltsignale angetrieben, zu denen auch Integrin- und Chemokin-Signale gehören.
Chemokine können grob in zwei Hauptklassen eingeteilt werden: (1) homöostatische Signale, die für die Differenzierung, das Überleben und die Basalfunktion essentiell sind, und (2) Entzündungssignale wie CXCL9, CXCL10 und CCL3, die für die Chemotaxis benötigt werden. Im Allgemeinen erzeugen Chemokine einen Signalgradienten, der die gerichtete Migration, die sogenannte Chemotaxis, antreibt und zusätzlich die Integrin-Expression1 aktiviert. Die Chemotaxis ist fein reguliert und hochempfindlich, wobei T-Zellen in der Lage sind, auf winzige Änderungen des Gradienten zu reagieren, die sie in eine bestimmte Richtung oder einen bestimmten Ort führen können.
Zusätzlich zu diesen T-Zell-bezogenen Faktoren wird die Migration auch von der Zusammensetzung und Dichte der extrazellulären Matrix (EZM) beeinflusst. Die EZM besteht aus einem dichten Netzwerk von Proteinen, darunter Kollagen und Proteoglykane, die das Gerüst für adhäsive Integrinrezeptoren auf T-Zellen bilden. Integrine sind eine vielfältige Familie von Transmembranproteinen, jedes mit hochspezialisierten Bindungsdomänen und nachgeschalteten Signaleffekten. Die dynamische Expression von Integrinrezeptoren auf der Oberfläche einer T-Zelle ermöglicht eine schnelle Anpassung an ihre sich verändernde Umgebung3. Wichtig ist, dass Integrine die EZM und intrazelluläre Zytoskelett-Aktinnetzwerke verbinden, die zusammenarbeiten, um die für die T-Zellbewegung erforderliche Antriebskraft zu erzeugen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Migrationsmuster je nach Phänotyp der Immunzellen oder Umweltsignalen variieren. Diese komplexen biologischen Prozesse werden durch die Expression von Zytokinen, Chemokinen und Integrinen auf der Oberfläche der T-Zelle, den umgebenden Zellen und dem lokalen, infizierten Gewebe streng reguliert. In vivo können diese Migrationsmechanismen komplex sein und sich aus mehreren additiven Signalen ergeben4. Aufgrund dieser Komplexität kann es unmöglich sein, einen kausalen Zusammenhang zwischen scheinbar ineinandergreifenden Variablen herzustellen. Um dies zu überwinden, gibt es mehrere In-vitro-Ansätze , um spezifische Aspekte der T-Zell-Migration zu untersuchen, wie z. B. die Reaktion auf spezifische Chemokinsignale und die Interaktion zwischen T-Zell-Integrinen und EZM-bindenden Proteinen. Dieses Protokoll befasst sich mit Methoden zur Isolierung und Aktivierung von murinen CD8+ T-Zellen mit In-vitro-Migrationsassays im zweidimensionalen Raum und computergestützten Analysewerkzeugen zur Analyse der spezifischen T-Zellmigration. Diese Verfahren sind für den Benutzer vorteilhaft, da sie keine ausgeklügelten Materialien oder Vorrichtungen erfordern, wie bei einigen anderen Zellmigrationsassays, die in der Literatur beschrieben sind. Die mit diesen Methoden erzeugten Zellmigrationsdaten können auf vereinfachte Weise Hinweise auf Immunantworten liefern, die eine weitere, fundierte Untersuchung in vivo ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without calcium and without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate non-TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3736</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>352350</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6KR centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34571</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall ST 16R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (IV)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354233</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>04200417C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Sheep anti-Rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 15 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy sep mouse T cell isolation kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>10838039001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cubes</td>
			<td>Nikon or Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GK1.5</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HQ CCD camera</td>
			<td>CoolSNAP</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/h</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ automatic tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.net/TrackMate</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ manual tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: Leibovitz&#8217;s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liebovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lok disposable syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphocyte separation medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-072-CI</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M5/114</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope heating system</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>okolab.com</td>
			<td>Custom designs available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C86024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort mouse CD8+ Na&#239;ve T cell isolation kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse E-cadherin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>8875-EC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-096</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-TC 24wp</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R9</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 &#956;M &#946;-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>575410</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S99385</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE2000-U microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various recombinant mouse chemokine</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VCAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>643-VM-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro migration assay for primary murine cd8+ t cells

Die adaptive Immunantwort beruht auf der Fähigkeit einer T-Zelle, als Reaktion auf Krankheitserreger und Fremdkörper durch Blut, Lymphe und Gewebe zu wandern. Die T-Zell-Migration ist ein komplexer Prozess, der die Koordination vieler Signaleingänge aus der Umwelt und lokalen Immunzellen erfordert, einschließlich Chemokinen, Chemokinrezeptoren und Adhäsionsmolekülen. Darüber hinaus wird die Motilität von T-Zellen durch dynamische Umgebungsreize beeinflusst, die den Aktivierungszustand, die Transkriptionslandschaft, die Expression von Adhäsionsmolekülen und vieles mehr verändern können. In vivo macht es die Komplexität dieser scheinbar miteinander verflochtenen Faktoren schwierig, einzelne Signale zu unterscheiden, die zur T-Zell-Migration beitragen. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Methoden, von der T-Zellisolierung bis hin zur computergestützten Analyse, um die T-Zellmigration in Echtzeit unter hochspezifischen Umweltbedingungen zu bewerten. Diese Bedingungen können dazu beitragen, Mechanismen aufzuklären, die die Migration regulieren, unser Verständnis der T-Zell-Kinetik zu verbessern und starke mechanistische Beweise zu liefern, die durch Tierversuche nur schwer zu erlangen sind. Ein tieferes Verständnis der molekularen Wechselwirkungen, die sich auf die Zellmigration auswirken, ist wichtig, um verbesserte Therapeutika zu entwickeln.

T cells are the major effectors of the adaptive, antigen-specific immune response. On a population level, T cells are heterogeneous, comprised of cellular subsets with distinct specialized functions. Importantly, CD8+ T cells are the main cytolytic effectors of the immune system, which directly eliminate infected or dysfunctional cells1.
Mature CD8+ T cells reside in tissue and circulate through blood and lymphatics in search of antigens. During infection, T cells are presented with antigens in blood or tissue and quickly drain to the spleen or nearest draining lymph node to begin a productive immune response. In either case, T cells become activated, undergo clonal expansion, and leave the lymphatic system to enter the blood, if not already there. During this process, intracellular signaling confers the downregulation of lymphatic homing receptors and the upregulation of numerous integrin and chemokine receptors essential for tissue-specific migration2. Ultimately, the directed migration of T cells to sites of infection is driven by converging environmental signals that include integrin and chemokine signaling.
Chemokines can be broadly categorized into two main classes: (1) homeostatic signals, which are essential for differentiation, survival, and basal function, and (2) inflammatory signals, such as CXCL9, CXCL10, and CCL3, which are required for chemotaxis. Generally, chemokines create a signal gradient that drives directional migration, known as chemotaxis, in addition to activating integrin expression1. Chemotaxis is finely regulated and highly sensitive, with T cells capable of responding to tiny changes in gradient that can lead them toward a specific direction or location.
In addition to these T cell-related factors, migration is also affected by the extracellular matrix (ECM) composition and density. The ECM is made up of a dense network of proteins, including collagen and proteoglycans, which provide the scaffold for adhesive integrin receptors on T cells. Integrins are a diverse family of transmembrane proteins, each with highly specialized binding domains and downstream signaling effects. Dynamic expression of integrin receptors on the surface of a T cell enables quick adaptation to their changing environments3. Importantly, integrins connect the ECM and intracellular cytoskeletal actin networks that work together to generate the propelling force required for T cell movement.
In summary, migration patterns vary based on the immune cell phenotype or environmental signals. These complex biological processes are tightly regulated by the expression of cytokines, chemokines, and integrins on the surface of the T cell, surrounding cells, and the local, infected tissue. In vivo, these migratory mechanisms can be&#160;complex and may result from several additive signals4. Due to this complexity, it can be impossible to establish a causal relationship between seemingly interlocked variables. To overcome this, there are several in vitro approaches to study specific aspects of T cell migration such as response to specific chemokine signals and the interaction between T cell integrins and ECM binding proteins. This protocol addresses methods to isolate and activate murine CD8+ T cells, with in vitro migration assays in two-dimensional space and computational analysis tools for analyzing specified T cell migration. These methods are advantageous to the user because they do not require sophisticated materials or devices, as with some other cell migration assays described in the literature. Cell migration data generated with these methods can&#160;provide evidence of immune responses in a simplistic manner that enables further, informed investigation in vivo.

Autor im Rampenlicht: Verständnis von Krankheitsmechanismen durch Echtzeitanalyse der T-Zell-Migration

Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen

The goal of our research is to understand T cell migration patterns in highly defined environmental conditions to enable informed in vitro experimentation and decipher molecular interactions impacting migration. Live imaging, such as intravital multiphoton microscopy, is used for in vivo understanding of immune cell kinetics. But microfluidic devices are a common in vitro tool that offer precise control over the microenvironment that cannot be afforded in a live specimen.Our protocol allows us to analyze intricate signaling pathways and provides better understanding for targeted in vitro experiments to further address the biological roles of individual signals in a cell type specific manner. Our method is simple, reproducible and easy to access in research labs that have a brightfield microscope featuring an attached digital camera. Therefore, our approach ensures a reliable set of methods to study dynamic cell migration events.Our lab will focus on investigating the migration of immune cells, including T cells and neutrophils in a variety of disease settings, such as tumors and infection, thereby comprehending the mechanisms that are important to regulate immune cell migration. This will help in developing the therapeutic methods to help treat and prevent disease.

Die Bestätigung der T-Zell-Aktivierung kann durch Durchflusszytometrie erreicht werden, wobei nach einer erhöhten Expression von CD69 und CD44 gesucht wird, die kanonische Marker für die Aktivierung in murinen T-Zellen sind6. Zusätzlich kann die Reinheit der T-Zellpopulation durch Durchflusszytometrie für CD3+ CD8+ T-Zellen bestimmt werden. Diese Methode ergibt >90 % CD8+ T-Zellpopulation.
Die T-Zell-Migration kann mit softwaregest?...

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur primären Isolierung von murinen T-Zellen und eine Zeitraffermikroskopie der T-Zellmigration unter spezifischen Umweltbedingungen mit quantitativer Analyse.

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

Das Ziel unserer Forschung ist es, die Migrationsmuster von T-Zellen unter genau definierten Umweltbedingungen zu verstehen, um fundierte In-vitro-Experimente zu ermöglichen und molekulare Wechselwirkungen zu entschlüsseln, die sich auf die Migration auswirken. Live-Bildgebung, wie z. B. die intravitale Multiphotonenmikroskopie, wird für das In-vivo-Verständnis der Kinetik von Immunzellen eingesetzt. Mikrofluidische Geräte sind jedoch ein gängiges In-vitro-Werkzeug, das eine präzise Kontrolle über die Mikroumgebung bietet, die sich eine lebende Probe nicht leisten kann.Unser Protokoll ermöglicht es uns, komplizierte Signalwege zu analysieren und bietet ein besseres Verständnis für gezielte In-vitro-Experimente, um die biologische Rolle einzelner Signale auf zelltypspezifische Weise weiter zu untersuchen. Unsere Methode ist einfach, reproduzierbar und in Forschungslaboren, die über ein Hellfeldmikroskop mit angeschlossener Digitalkamera verfügen, leicht zugänglich. Daher gewährleistet unser Ansatz ein zuverlässiges Methodenset zur Untersuchung dynamischer Zellmigrationsereignisse.Unser Labor wird sich auf die Untersuchung der Migration von Immunzellen, einschließlich T-Zellen und Neutrophilen, in einer Vielzahl von Krankheitsumgebungen, wie Tumoren und Infektionen, konzentrieren, um die Mechanismen zu verstehen, die für die Regulierung der Immunzellmigration wichtig sind. Dies wird bei der Entwicklung therapeutischer Methoden zur Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten helfen.

real-time-in-vitro-migration-assay-for-primary-murine-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

724 Aufrufe.  University of Rochester. Das Ziel unserer Forschung ist es, die Migrationsmuster von T-Zellen unter genau definierten Umweltbedingungen zu verstehen, um fundierte In-vitro-Experimente zu ermöglichen und molekulare Wechselwirkungen zu entschlüsseln, die sich auf die Migration auswirken. Live-Bildgebung, wie z. B. die intravitale Multiphotonenmikroskopie, wird für das In-vivo-Verständnis der Kinetik von Immunzellen eingesetzt. Mikrofluidische Geräte sind jedoch ein gängiges In-vitro-Werkzeug, das eine präzise Ko...

Serie: Autor im Rampenlicht: Verständnis von Krankheitsmechanismen durch Echtzeitanalyse der T-Zell-Migration

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.