Nachdem Sie homogenisiertes intermuskuläres Fettgewebe des Menschen in einem 1,7-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung auf Eis gesammelt haben, geben Sie 14 Mikroliter 10 % Triton X-100 zum Homogenat. Inkubieren Sie das Röhrchen 10 bis 15 Minuten lang dunkel auf Eis und wirbeln Sie es alle drei Minuten vortexen. In einem separaten konischen 15-Milliliter-Röhrchen ein 100- und ein 40-Mikron-Zellsieb mit 100 Mikrolitern DPBS vorbefeuchten.
Filtrieren Sie das Homogenat durch ein 100-Mikron-Zellsieb. Spülen Sie ein 1,7-Milliliter-Low-Bind-Röhrchen mit 400 Mikrolitern Homogenisierungspuffer und filtrieren Sie die Suspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb. Als nächstes filtrieren Sie die durch 100-Mikron-Filtrat erhaltene Suspension auf einem 40-Mikron-Zellsieb.
Verteilen Sie die Lösung gleichmäßig auf zwei vorgekühlte 1,7-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2700 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entsorgen Sie die oberste Lipidschicht und den Überstand, so dass sich etwa 50 Mikroliter in der ersten Tube befinden.
Pipettieren Sie vorsichtig 20 Mal auf und ab, ohne Blasen zu bilden, um das Pellet im ersten Röhrchen wieder zu suspendieren und die Suspension in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung zu übertragen. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Kernisolationsmedium in das 1,7-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung und mischen Sie es durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1000 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand, lassen Sie ca. 50 Mikroliter im Röhrchen und pipettieren Sie vorsichtig, um das Pellet wieder zu suspendieren. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Kernisolationsmedium hinzu und mischen Sie die Suspension. Geben Sie einen Tropfen der Lebendzellfärbelösung hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln auf Eis.
Nach 15 Minuten filtrieren Sie die Lösung durch ein 30-Mikron-Zellsieb. Mischen Sie die Zellkernlösung und geben Sie 10 Mikroliter in einen Objektträger der Zellzählkammer. Zählen Sie die Zellkerne mit einem automatisierten Zellzähler.
