Pipettieren Sie zunächst ein bis zwei Milliliter Anti-Adhärenz-Spüllösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Schwenken Sie das Rohr, um seine Oberfläche zu beschichten. Pipettieren Sie anschließend fünf Milliliter DPBS-Lösung in das Röhrchen, nachdem Sie die Anti-Adhärenz-Lösung entfernt haben.
Verschließen Sie die beschichteten Tuben, bis sie benötigt werden. Pipettieren Sie ein beliebiges Medium in einer Platte aus, die die Organoid-Kuppeln des menschlichen Darms enthält. Geben Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette einen Milliliter kaltes DMEM/F-12-Medium direkt in die Kuppel, um es von der Platte zu lösen.
Pipettieren Sie einen weiteren Milliliter des Mediums, um alle verbleibenden Organoide zu ernten. Übertragen Sie die Suspension in die beschichteten konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie die Suspension auf und ab, um Organoide zu zersetzen, bis eine gleichmäßige Fragmentsuspension mit der gewünschten Organoidgröße entsteht.
Als nächstes pipettieren Sie ein Aliquot der Suspension zum Zählen heraus. Lege die restliche Suspension auf Eis. Zeichnen Sie ein XY-Gitter am unteren Rand jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden.
Pipettieren Sie 50 Mikroliter DPBS in die Vertiefungen. Übertragen Sie fünf Mikroliter des Aliquots in jede Vertiefung. Zählen Sie manuell die Gesamtzahl der Organoide mit einem Durchmesser von 50 bis 200 Mikrometern.
Verwenden Sie dann die angegebene Gleichung, um das Volumen der Organoidsuspension zu berechnen. Nach dem Zählen der Organoide ist der Überstand und die trübe Schicht aus dem Röhrchen mit der restlichen Klumpensuspension zu entfernen. Pipettieren Sie dann zwei Milliliter kaltes DMEM/F-12 direkt auf das Pellet.
Die Suspension wird bei 200 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Für ein tierisches System fügen Sie 40 Mikroliter kaltes Organoid-Pellet mit einer tierischen Matrix hinzu. Pipettieren Sie die Organoide auf und ab, um sie in der Matrix zu verteilen.
Übertragen Sie die Matrix-Organoid-Mischung vorsichtig in die Mitte einer sterilen, vorgewärmten 24-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um eine Domgelierung zu gewährleisten. Pipettieren Sie anschließend 0,5 Milliliter warmes Darmorganoid-Wachstumsmedium an die Seiten der Vertiefung, ohne die Kuppel vor der Inkubation zu stören.
Für das xenofreie Organoidsystem der Matrix vier fügen Sie dem Sphäroid-Pellet 50 Mikroliter 3X Organoid-Wachstumsmedium hinzu. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter der ausgewählten Matrix mit vier xenofreien Organoiden in die Suspension. Geben Sie 40 Mikroliter der Hydrogel-Organoidmischung in die Mitte einer 24-Well-Gewebekulturplatte.
Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation pipettieren Sie 0,5 Milliliter organoides Wachstumsmedium entlang der Seiten der Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte dann erneut bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxidzusatz und 95 % Luftfeuchtigkeit.
